Src同源磷酸酪氨酸磷酸酶2促進α-干擾素誘導的Jak-Stat1信號通路從而抑制呼吸道合胞病毒復制.pdf

1、研究背景:
　　呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）是引起嬰幼兒呼吸道感染最主要的病原體。嬰幼兒住院病例中約有40％-50％的毛細支氣管炎和25％的肺炎是由RSV感染所致。非高危人群感染RSV可僅引起普通感冒，但亦有小部分(0.5-2％)發(fā)展為嚴重的毛細支氣管炎和肺炎;嬰兒期嚴重RSV感染與少年期哮喘發(fā)生密切相關(guān)。由于RSV致病機制尚未闡明，目前尚無有效藥物、疫苗問世。治療和預防RSV感

2、染導致的疾病的難點在于RSV在與宿主斗爭過程中進化出了多種免疫逃避機制，包括抑制T細胞增殖作用，抑制DC細胞活化和功能，RSV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2可以抑制IFN-α產(chǎn)生和發(fā)揮抗病毒作用。
　　酪氨酸激酶的磷酸化作用與酪氨酸磷酸酶的去磷酸化作用是生物體內(nèi)普遍存在的調(diào)控細胞信號轉(zhuǎn)導過程的重要作用方式，它們共同調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化水平。Src同源磷酸酪氨酸磷酸酶2(Src homology phospho-tyrosylp

3、hosphatase2，SHP2)是起去磷酸化作用的一種非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶。SHP2是PTPs家族中的一員，它廣泛的表達在人體各種組織和細胞中，由基因PTPN11編碼，其N末端含有2個SH2結(jié)構(gòu)域。SHP2可以通過SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合磷酸酪氨酸，由于構(gòu)象的改變使其自身結(jié)構(gòu)中的酪氨酸蛋白磷酸酶（PTP酶）激活，對細胞內(nèi)其他信號分子發(fā)揮去磷酸化的作用，故SHP2對細胞內(nèi)的信號分子具有重要的調(diào)控作用。
　　干擾素（interferon

4、，IFN）是由病毒或其他激活劑刺激宿主細胞所分泌的一類細胞因子，具有廣譜的抗病毒作用。IFN通過與其相應的受體結(jié)合，激活Jak/Stat(janus kinase，Jak; signal transducer and activator of transcription，Stat)信號通路，該信號經(jīng)過轉(zhuǎn)導和細胞內(nèi)信號的級聯(lián)放大作用，最終引發(fā)各類抗病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄表達，從而發(fā)揮其抗病毒作用。關(guān)于RSV與IFN之間的相關(guān)性研究，目前已知RSV

5、可通過其非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structual protein，NS)干擾宿主細胞產(chǎn)生IFN，但是否與IFN的效應階段有關(guān)，目前尚未明確。IFN誘導活化的信號傳遞過程受三類重要的蛋白家族調(diào)控，分別是蛋白酪氨酸磷酸酶家族(protein tyrosine phosphatases，PTPs)、細胞因子信號抑制物家族(Suppressor of cytokine signaling，SOCSs)和活化的STAT轉(zhuǎn)錄活性抑制蛋白家族（prot

6、ein inhibitor of activated STAT，PIAS）。這三大蛋白家族主要作用為負反饋調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號通路以防止信號通路的過度激活。在IFN相關(guān)調(diào)控中，SHP2被證明是一種具有雙重功能的蛋白，既可直接負反饋調(diào)節(jié)信號通路起到負調(diào)控作用，亦可通過干擾信號通路中其它調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控作用起到間接正向調(diào)控作用。然而，SHP2在RSV感染中的作用以及相關(guān)機制還有待研究。
　　研究目的:
　　研究SHP2在RSV感染中的作

7、用及其相關(guān)的機制，為RSV致病機制尤其是RSV免疫逃逸機制研究提供依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.細胞實驗:
　　1.1以RSV感染人非小細胞肺癌細胞A549為模型，通過RT-qPCR以及Westernblot分別檢測Shp2基因及蛋白表達;以特異性化學抑制劑PHPS1(phenylhydrazono pyrazolone sulfonate1)抑制細胞內(nèi)SHP2的功能，通過RT-qPCR檢測RSV病毒結(jié)構(gòu)蛋白F蛋白表

8、達和病毒空斑形成實驗(Plaque assay)檢測RSV成熟病毒顆粒數(shù)量來明確RSV的復制情況;通過RT-qPCR檢測SHP2對RSV感染后IFN-α產(chǎn)生的影響;以外源性IFN-α事先激活細胞Jak/Stat信號通路，用PHPS1抑制SHP2功能，通過RT-qPCR檢測RSV病毒結(jié)構(gòu)蛋白F的表達以及檢測IFN-α下游的效應分子2'，5'-OAS1的表達來明確SHP2對RSV復制的影響和IFN-α信號通路的影響;通過Western bl

9、ot檢測Jak/Stat信號通路中Jak1和Stat1磷酸化水平的變化。
　　1.2以RSV感染SHP2敲除的腹腔來源巨噬細胞和骨髓來源巨噬細胞，研究SHP2對免疫細胞中病毒復制的直接影響，通過RT-qPCR檢測RSV病毒結(jié)構(gòu)蛋白F蛋白的表達。
　　2.動物實驗:
　　以RSV經(jīng)滴鼻感染野生型C57BL/6小鼠以及巨噬細胞特異性SHP2基因敲除小鼠，通過RT-qPCR檢測RSV病毒結(jié)構(gòu)蛋白F蛋白的表達和炎癥因子IL-4

10、等的表達，肺組織HE檢測肺部的炎癥情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.RSV感染12小時后，人非小細胞肺癌細胞A549中SHP2的蛋白表達水平明顯增高。
　　2.以特異性SHP2抑制劑PHPS1預處理A549細胞，RSV感染后，病毒RSV-F的表達以及細胞表達IFN-α的未受影響。
　　3.先后以IFN-α、PHPS1預處理A549細胞，RSV感染后，病毒RSV-F的表達以及成熟病毒顆粒的釋放均增加;與之相對應細胞內(nèi)

11、Jak/Stat1信號通路中關(guān)鍵信號分子Stat1的磷酸化水平受到抑制、Jak/Stat1信號通路誘導活化的抗病毒蛋白2'，5'-OAS1的表達明顯下降。
　　4.RSV感染從巨噬細胞特異性SHP2基因敲除小鼠體內(nèi)分離的骨髓來源巨噬細胞BMM/以及腹腔巨噬細胞PM，與野生型小鼠來源的細胞相比，病毒RSV-F表達水平升高。
　　5.RSV感染單核細胞特異性SHP2基因敲除小鼠，與野生型小鼠相比，病毒在肺組織內(nèi)RSV-F蛋白表達

12、無明顯差異;小鼠肺炎的病理改變以及肺內(nèi)炎癥因子的表達均沒有明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1.RSV感染的上皮細胞中，SHP2對IFN-α產(chǎn)生無影響，但對IFN-α效應起正向調(diào)控作用;SHP2可促進α-干擾素誘導的Jak/Stat1信號通路從而抑制RSV的復制。
　　2.在RSV感染的巨噬細胞中，SHP2直接抑制RSV的復制。僅在小鼠的單核細胞中敲除SHP2對RSV復制沒有影響。提示SHP2在巨噬細胞中可能起到與上皮細胞不