維生素D在成骨細(xì)胞骨分化中的分子機(jī)制及骨質(zhì)疏松與動脈鈣化相關(guān)性的臨床研究.pdf

1、目的：
　　骨質(zhì)疏松癥是嚴(yán)重危害老年人群健康的慢性骨代謝病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，防治難度大。維生素D是體內(nèi)調(diào)節(jié)骨代謝的一種重要激素，可通過間接作用和對成骨細(xì)胞的直接作用影響骨形成，因此維生素D在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制及防治中起重要作用。本研究的第一部分以人原代成骨細(xì)胞（primary human osteoblasts, hOBs）和MG63成骨細(xì)胞系為模型，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組高通量測序手段，在轉(zhuǎn)錄和剪接水平探討了hnRNPC1/C2對1，25

2、(OH)2D介導(dǎo)的成骨細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控的影響。第二、三和第四部分通過對一組60歲以上老年人群的觀察性研究，探討了老年患者動脈鈣化和骨質(zhì)疏松及骨折之間相關(guān)性。
　　方法：
　　第一部分
　　1.使用hOBs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，并于hOBs人工過表達(dá)hnRNPC1/C2，利用熒光定量PCR(qPCR)檢測1，25(OH)2D誘導(dǎo)的RUNX2，BGLAP，SPP1及COL1A1等成骨標(biāo)志基因的表達(dá)變化。
　　2.使用MG

3、63人成骨細(xì)胞系，并以CYP24A1基因?yàn)檠芯繉ο?，采用染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)以及RNA免疫共沉淀(RNAimmunoprecipitation，RIP)技術(shù)，驗(yàn)證VDR和hnRNPC1/C2與CYP24A1基因上游啟動子區(qū)域VDREs以及CYP24A1 mRNA的相互作用。
　　3.通過RNA干擾(RNA interference，RNAi)手段在MG63人成骨細(xì)

4、胞沉默hnRNPC1/C2，并采用qPCR以及熒光標(biāo)記PCR，在轉(zhuǎn)錄和剪接水平檢測hnRNPC1/C2沉默對1，25(OH)2D調(diào)控的CYP24A1的基因表達(dá)影響。
　　4.最后，通過對MG63成骨細(xì)胞的高通量RNA測序(RNA-seq)結(jié)合生物信息學(xué)方法對基因的差異表達(dá)及選擇性剪接進(jìn)行分析，在全基因組水平探討了1，25(OH)2D與hnRNPC1/C2對基因表達(dá)和選擇性剪接的作用以及這兩個環(huán)節(jié)之間的相互聯(lián)系。
　　第二部分

5、
　　1.本研究從2012年1月1日到12月31日，篩選60歲以上符合條件的來院就診患者為研究對象。
　　2.主動脈鈣化程度的半定量測量:應(yīng)用腰椎X線側(cè)位片對第1-4腰椎對應(yīng)的腹主動脈鈣化沉積物進(jìn)行評分。根據(jù)鈣化斑塊的長度和累及的節(jié)段數(shù)，每位患者的主動脈鈣化評分(ACS)為0-24分不等，無主動脈鈣化是0分，最嚴(yán)重的主動脈鈣化是24分。并依據(jù)ACS將患者分為4組:G1，ACS=0;G2，ACS=1-2; G3, ACS=3-

6、6;G4, ACS＞6。
　　3.骨密度檢測使用雙能X線吸收儀測量(DXA)。骨質(zhì)疏松癥定義為基于DXA測定的骨密度值低于同性別、同種族正常成年人骨峰值2.5個標(biāo)準(zhǔn)差或以上。
　　4.采用多因素回歸風(fēng)險模型評估主動脈鈣化和骨質(zhì)疏松癥發(fā)生風(fēng)險的關(guān)系。
　　第三部分
　　1.與第二部分研究同期，篩選60歲以上符合條件的絕經(jīng)后婦女為研究對象。
　　2.主動脈鈣化程度的半定量測量同第二部分。
　　3.椎骨骨折

7、的診斷:通過X線片觀察椎體形態(tài)（胸4-腰5節(jié)段）確定椎骨骨折的發(fā)生（椎體高度下降20％以上）。
　　4.采用多因素回歸分析模型評估主動脈鈣化和椎骨骨折之間的關(guān)系。
　　第四部分
　　1.與第二部分研究同期，篩選60歲以上符合條件的來院就診患者為研究對象。
　　2.骨密度檢測及骨質(zhì)疏松癥的診斷同第二部分。
　　3.頸動脈和冠狀動脈粥樣硬化鈣化斑塊檢測:使用64排螺旋CT行頸動脈和冠狀動脈CTA。三維圖像分析工

8、作站評估所有CTA圖像。并對動脈斑塊的成分和發(fā)生范圍進(jìn)行評價。
　　4.采用多因素回歸風(fēng)險模型分析骨質(zhì)疏松和骨量丟失與頸動脈和冠狀動脈鈣化斑塊發(fā)生風(fēng)險之間關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.hOBs過表達(dá)hnRNPC1/C2顯著抑制了1，25(OH)2D對成骨細(xì)胞骨形成標(biāo)志基因RUNX2、BGLAP的激活。
　　2.MG63成骨細(xì)胞中，hnRNPC1/C2與VDR競爭結(jié)合VDREs; hnRNPC1/

9、C2與CYP24A1 mRNA的結(jié)合則與VDR無關(guān)。
　　3.MG63成骨細(xì)胞中，hnRNPC1/C2沉默在影響CYP24A1轉(zhuǎn)錄的同時導(dǎo)致CYP24A1異常選擇性剪接的發(fā)生。
　　4.RNA-seq檢測基因的差異表達(dá):1，25(OH)2D處理MG63成骨細(xì)胞共檢測出324個差異表達(dá)基因:其中有187個基因?qū)?，25(OH)2D的反應(yīng)不受hnRNPC1/C2沉默的影響，有137個基因在hnRNPC1/C2沉默后失去對1，25

10、(OH)2D反應(yīng)。而在hnRNPC1/C2沉默后，新出現(xiàn)168個1，25(OH)2D應(yīng)答基因。
　　5.RNA-seq檢測基因的選擇性剪接:1，25(OH)2D處理MG63細(xì)胞共引起310個選擇性剪接事件;1，25(OH)2D誘導(dǎo)的選擇性剪接事件在hnRNPC1/C2沉默后增加(390個)，而只有3個事件(＜1％)也出現(xiàn)在hnRNPC1/C2存在時1，25(OH)2D誘導(dǎo)所致的選擇性剪接事件中。
　　6.1，25(OH)2D

11、處理導(dǎo)致的324個差異表達(dá)基因中，只有9個基因同時出現(xiàn)選擇性剪接。與單獨(dú)1，25(OH)2D處理相比較，hnRNPC1/C2沉默聯(lián)合1，25(OH)2D處理導(dǎo)致有811個基因（22.7％/27.4％）同時出現(xiàn)差異表達(dá)和選擇性剪接。
　　第二部分
　　1.1448例完成本項(xiàng)研究的老年受訪者的平均年齡為72.0±4.5歲，有397例(27.4％)發(fā)生了骨質(zhì)疏松癥。
　　2.與無骨質(zhì)疏松癥組相比，骨質(zhì)疏松癥組年齡更加老化、女

12、性更多(P＜0.01);骨質(zhì)疏松癥組的椎骨、股骨頸、股骨粗隆和全髖部的骨密度更低(P＜0.01);血清Ⅰ型原膠原N-端前肽(PINP)、Ⅰ型膠原交聯(lián)C-末端肽(CTX)水平更高(P＜0.05);總脫氧吡啶(Total DPD)、游離脫氧吡啶(Free DPD)水平更高(P＜0.01);25羥維生素D[25(OH)D]水平更低(P＜0.01)。
　　3.在調(diào)整年齡和其他潛在混雜因素以后，ACS(G4)、BMD、25(OH)D、CTX

13、、現(xiàn)在吸煙、每日飲酒與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生密切相關(guān)。骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的風(fēng)險隨著ACS的增加而升高，但只在ACS G4組與G1組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。較高的ACS在女性和男性均與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生相關(guān)。
　　第三部分
　　1.在1359例絕經(jīng)后婦女中，有173例(12.7％)發(fā)生了骨折，其中包括92例椎骨骨折，81例發(fā)生了非椎骨骨折。
　　2.主動脈鈣化組脊柱骨折的發(fā)生率明顯高于無主動脈鈣化組(P＜0.01)。
　　3.在調(diào)整

14、年齡等其他混雜因素后，發(fā)現(xiàn)骨密度、年齡、2次及以上跌倒史、25(OH)D、脂聯(lián)素與椎骨骨折密切相關(guān)。與ACS G1組相比，G3和G4組椎骨骨折發(fā)生風(fēng)險更高。
　　第四部分
　　1.1393例老年受訪者完成研究，其中474例發(fā)生動脈鈣化斑塊，包括158例(33.4％)頸動脈鈣化斑塊，195例(41.1％)冠狀動脈鈣化斑塊和121例(25.5％)頸動脈和冠狀動脈共存鈣化斑塊。
　　2.在調(diào)整年齡等其他混雜因素后，骨質(zhì)疏松癥

15、、低骨量、血25(OH)D水平下降與動脈鈣化斑塊的發(fā)生密切相關(guān)。
　　3.在調(diào)整年齡等其它混雜因素后，嚴(yán)重的骨量丟失與頸動脈斑塊、冠狀動脈斑塊及共存的鈣化斑塊的發(fā)生均顯著相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.過表達(dá)hnRNPC1/C2顯著抑制了1，25(OH)2D對成骨細(xì)胞骨形成標(biāo)志基因RUNX2、BGLAP的反式激活;1，25(OH)2D可在轉(zhuǎn)錄和mRNA剪接兩個水平調(diào)控成骨細(xì)胞基因表達(dá);hnRNPC1/C2可在轉(zhuǎn)錄和mRNA

16、剪接水平參與協(xié)調(diào)1，25(OH)2D對成骨細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控。
　　2.在老年人群中，嚴(yán)重的主動脈鈣化與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生相關(guān)。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生風(fēng)險隨著ACS的增加而升高。骨密度降低和血25(OH)D水平下降也與骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的相關(guān)。
　　3.在老年絕經(jīng)后婦女中，嚴(yán)重的主動脈鈣化與椎骨骨折的發(fā)生相關(guān)。骨密度降低和血25(OH)D水平下降與椎骨骨折的發(fā)生相關(guān)。
　　4.在老年人群中，骨質(zhì)疏松癥、低骨量及血25(OH)D水平

17、下降與動脈鈣化斑塊的發(fā)生相關(guān);嚴(yán)重的骨量丟失與頸動脈斑塊、冠狀動脈斑塊及共存的鈣化斑塊的發(fā)生風(fēng)險均相關(guān)。
　　本研究揭示了維生素D對成骨細(xì)胞直接調(diào)控作用的新的分子機(jī)制，為認(rèn)識維生素D在成骨細(xì)胞骨分化，骨代謝及代謝性骨病中的作用機(jī)制開啟了一個全新的視角，對深入探索骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制，尋找新的藥物治療靶點(diǎn)具有重要意義。同時，對一組老年人群的觀察性研究揭示了老年病的一些共同危險因素及內(nèi)在的相互關(guān)系，對骨質(zhì)疏松癥及心血管疾病的防治具有重