N-乙酰-D-葡萄糖胺2-異構(gòu)酶的克隆、表達(dá)及活性鑒定.pdf

1、流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病,它嚴(yán)重威脅人類生命健康。流感包括季節(jié)性流感和非季節(jié)性流感,普通季節(jié)性流感每年大約引起全球數(shù)十萬(wàn)人死亡。高致病性流感(主要是H5N1型)是近年來(lái)一直威脅人類生命健康的重大疾病,患者病死率極高。自2009年3月墨西哥和美國(guó)先后發(fā)生人感染H1N1病毒事件以來(lái),甲型H1N1流感已在全球蔓延傳播。
　　 治療流感已成為當(dāng)前迫在眉睫的問題。神經(jīng)氨酸酶抑制劑扎那米韋和奧斯米韋是目前僅有的兩種治療藥物。N

2、-乙酰-D-神經(jīng)氨酸是化學(xué)合成扎那米韋的關(guān)鍵中間體,也是合成其他抗流感藥物的主要原料。N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸目前由酶法催化合成。酶法催化的途徑之一是首先由N-乙酰-D-葡萄糖胺2-異構(gòu)酶將N-乙酰-D-葡萄糖胺異構(gòu)化為N-乙酰-D-甘露糖胺,再由神經(jīng)氨酸醛縮酶催化后者與丙酮酸之間的縮合而得到N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸。N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸的價(jià)格高昂(每公斤2萬(wàn)元),這就使得扎那米韋的價(jià)格居高不下。尋找高活性的酶,提高轉(zhuǎn)化率是降低N-乙酰-

3、D-神經(jīng)氨酸的價(jià)格及至扎那米韋的價(jià)格關(guān)鍵因素。
　　 酶法催化合成神經(jīng)氨酸的成功實(shí)例為日本丸金食品有限公司Maru等研究人員以N-乙酰-D-葡萄糖胺和丙酮酸為原料,經(jīng)過在大腸桿菌中表達(dá)并純化的豬腎來(lái)源的異構(gòu)酶(pRnBP)和大腸桿菌來(lái)源的醛縮酶(Escherichia coli nanA)的催化,生成神經(jīng)氨酸。目前存在的問題是:酶的活性仍相對(duì)較低、催化反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化率仍有提高的余地。同樣重要的是,目前工業(yè)化生產(chǎn)的酶已被國(guó)外公

4、司專利保護(hù)。
　　 針對(duì)上述問題,本研究通過PCR手段克隆了三種新型的N-乙酰-D-葡萄糖胺異構(gòu)酶,該酶是自將多擬形桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron VPI-54-82)的三段基因BT-0453、BT-3605及BT-0437克隆至表達(dá)載體pET30a(+)后,分別構(gòu)建了質(zhì)粒pLS125,pLS1005,pLS1006并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。序列同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn),其與pRnBP的全長(zhǎng)一致性,全長(zhǎng)相似

5、性均達(dá)到45％以上。利用PMP柱前衍生化法,通過高效液相色譜分析測(cè)定了三種異構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù),以及各自的Km、Kcat以及其比值。
　　 以N-乙酰-D-葡萄糖胺和丙酮酸為底物,選擇三種相同來(lái)源的異構(gòu)酶和大腸桿菌來(lái)源的神經(jīng)氨酸醛縮酶進(jìn)行了雙酶偶聯(lián)的催化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明HisBT0453蛋白活性較高。以全細(xì)胞進(jìn)行催化,37℃下反應(yīng)12小時(shí),生成N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸的摩爾收率為15％,質(zhì)量收率為21.2％;以純酶進(jìn)行催化,37℃下反