基于1HNMR的代謝組學技術在移植供肝質(zhì)量和功能評估中的臨床實驗研究.pdf

1、目的：
　　本研究擬以核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance，1HNMR)代謝組學技術為基礎，在臨床實際中建立移植肝臟保存模型，對移植肝臟低溫保存中不同時間節(jié)點的代謝組進行研究，分析在低溫保存中的代謝變化，建立以核磁共振氫譜(1Hnuclear magnetic resonance，1HNMR)代謝組學在移植供肝質(zhì)量和功能評估中新方法。
　　方法：
　　(1)隨機選取40例低溫保存移植

2、肝臟，供體年齡控制在50歲以內(nèi)，性別隨機分配。根據(jù)離體肝臟保存的不同時間（基點0h、4h、8h、12h）每例取保存液2ml，每個時間點10例樣本，收集到的UW液應自門靜脈原位灌注后，至肝臟顏色變?yōu)橥咙S色，從上下腔靜脈和下下腔靜脈流出收集，收集后立即放置液氮中保存以備使用。首先對采集到樣本制備，然后使用Varian UNITY INOVA600 MHz超導脈沖傅立葉變換核磁共振譜儀采集保存液樣本和組織提取物的核磁共振數(shù)據(jù)(NMR)。NMR

3、圖譜是由自由感應衰減(free induction decay，F(xiàn)ID)信號經(jīng)超導脈沖傅立葉轉(zhuǎn)換而來，最后所有的數(shù)據(jù)輸出并保存，用于模式識別分析。把保存的數(shù)據(jù)先由Pareto標度化(Pareto scaling)和平均中心化(mean centering)進行預處理，再由SIMCA-P12.0軟件(v12.0，Umetrics，Ume，Sweden)將得到的數(shù)據(jù)采用主成分分析法(principalcomponent analysis，P

4、CA)分析，為強化組間差異，進一步采用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)或正交信號校正(OSC)分析。以得分圖(scores plot)和因子載荷圖(loadings plot)的形式表示分析結(jié)果。四組保存液樣本代謝物的歸一化積分值采用統(tǒng)計學SPSS17.0對單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　(2)建立以1HNMR代謝組學技術為基礎的肝臟保存液代謝組學平臺，探討1HNMR技術在移植肝臟保存中

5、功能評估和質(zhì)量評估應用的可行性，并通過UW液的在不同時期的代謝變化，同時找出引起這些差異變化的主要代謝物，作為潛在的標志物。
　　結(jié)果：
　　1、1H-NMR譜圖中可以看出，UW保存液中棉子糖(Raffinose)、腺苷(Adenosine)、檸檬酸鹽（Citrate）、琥珀酸鹽(Sueeinate)、乙酸（Ethanol）、肌酸/肌酐(creatine/creatinine)、次黃苷(Inosine)、乳酸（Lactate

6、）丙氨酸、等代謝物的含量在不同時期發(fā)生了變化，而次黃嘌呤(Allopurinol)、谷胱甘肽(Glutathione)、膽堿(Choline)、等代謝物則變化不明顯。
　　2、對0h、4h、8h、12h混合組先進行了PCA和OPLS-DA分析。其中0h灌注的UW液樣本有明顯的聚集情況，而4h、8h及12h明顯的與0h分開，且較為分散，從PCA載荷圖是可以看出明顯的差別的，說明隨著保存時間的延長，各組都發(fā)生了明顯的代謝變化，是但4h

7、、8h、12h樣本之間的氫譜圖之間存在一定重疊。
　　3、在4h與8h、4h與12h以及8h與12h之間進行了PCA和OPLS-DA模式識別分析，各組之間代謝差異明顯，特別是顯現(xiàn)在OPLS-DA模式識別分析。找出每組之間差異明顯的積分區(qū)段所對應的代謝物質(zhì)，也是影響著移植供肝代謝變化明顯的生物標志物。其中琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸、谷氨酰胺以及次黃苷，腺嘌呤、葡萄糖的代謝是引起4h、8h、12h組與基準點差異最大的代謝物。