基于1HNMR的代謝組學(xué)技術(shù)在移植供肝質(zhì)量和功能評(píng)估中的臨床實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　本研究擬以核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance，1HNMR)代謝組學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，在臨床實(shí)際中建立移植肝臟保存模型，對(duì)移植肝臟低溫保存中不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的代謝組進(jìn)行研究，分析在低溫保存中的代謝變化，建立以核磁共振氫譜(1Hnuclear magnetic resonance，1HNMR)代謝組學(xué)在移植供肝質(zhì)量和功能評(píng)估中新方法。
　　方法：
　　(1)隨機(jī)選取40例低溫保存移植

2、肝臟，供體年齡控制在50歲以內(nèi)，性別隨機(jī)分配。根據(jù)離體肝臟保存的不同時(shí)間（基點(diǎn)0h、4h、8h、12h）每例取保存液2ml，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10例樣本，收集到的UW液應(yīng)自門靜脈原位灌注后，至肝臟顏色變?yōu)橥咙S色，從上下腔靜脈和下下腔靜脈流出收集，收集后立即放置液氮中保存以備使用。首先對(duì)采集到樣本制備，然后使用Varian UNITY INOVA600 MHz超導(dǎo)脈沖傅立葉變換核磁共振譜儀采集保存液樣本和組織提取物的核磁共振數(shù)據(jù)(NMR)。NMR

3、圖譜是由自由感應(yīng)衰減(free induction decay，F(xiàn)ID)信號(hào)經(jīng)超導(dǎo)脈沖傅立葉轉(zhuǎn)換而來(lái)，最后所有的數(shù)據(jù)輸出并保存，用于模式識(shí)別分析。把保存的數(shù)據(jù)先由Pareto標(biāo)度化(Pareto scaling)和平均中心化(mean centering)進(jìn)行預(yù)處理，再由SIMCA-P12.0軟件(v12.0，Umetrics，Ume，Sweden)將得到的數(shù)據(jù)采用主成分分析法(principalcomponent analysis，P

4、CA)分析，為強(qiáng)化組間差異，進(jìn)一步采用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)或正交信號(hào)校正(OSC)分析。以得分圖(scores plot)和因子載荷圖(loadings plot)的形式表示分析結(jié)果。四組保存液樣本代謝物的歸一化積分值采用統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS17.0對(duì)單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)建立以1HNMR代謝組學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的肝臟保存液代謝組學(xué)平臺(tái)，探討1HNMR技術(shù)在移植肝臟保存中

5、功能評(píng)估和質(zhì)量評(píng)估應(yīng)用的可行性，并通過(guò)UW液的在不同時(shí)期的代謝變化，同時(shí)找出引起這些差異變化的主要代謝物，作為潛在的標(biāo)志物。
　　結(jié)果：
　　1、1H-NMR譜圖中可以看出，UW保存液中棉子糖(Raffinose)、腺苷(Adenosine)、檸檬酸鹽（Citrate）、琥珀酸鹽(Sueeinate)、乙酸（Ethanol）、肌酸/肌酐(creatine/creatinine)、次黃苷(Inosine)、乳酸（Lactate

6、）丙氨酸、等代謝物的含量在不同時(shí)期發(fā)生了變化，而次黃嘌呤(Allopurinol)、谷胱甘肽(Glutathione)、膽堿(Choline)、等代謝物則變化不明顯。
　　2、對(duì)0h、4h、8h、12h混合組先進(jìn)行了PCA和OPLS-DA分析。其中0h灌注的UW液樣本有明顯的聚集情況，而4h、8h及12h明顯的與0h分開，且較為分散，從PCA載荷圖是可以看出明顯的差別的，說(shuō)明隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，各組都發(fā)生了明顯的代謝變化，是但4h

7、、8h、12h樣本之間的氫譜圖之間存在一定重疊。
　　3、在4h與8h、4h與12h以及8h與12h之間進(jìn)行了PCA和OPLS-DA模式識(shí)別分析，各組之間代謝差異明顯，特別是顯現(xiàn)在OPLS-DA模式識(shí)別分析。找出每組之間差異明顯的積分區(qū)段所對(duì)應(yīng)的代謝物質(zhì)，也是影響著移植供肝代謝變化明顯的生物標(biāo)志物。其中琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸、谷氨酰胺以及次黃苷，腺嘌呤、葡萄糖的代謝是引起4h、8h、12h組與基準(zhǔn)點(diǎn)差異最大的代謝物。