人軟骨終板干細(xì)胞與髓核細(xì)胞體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　在骨科這一學(xué)科的門診及臨床實(shí)踐工作中，腰椎間盤突出癥是一種最為常見的嚴(yán)重困擾人們健康、影響廣大勞動人民正常工作與生活的慢性腰椎退行性疾患。該疾患具有發(fā)病率高、慢性及長期反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，伴隨著當(dāng)今生活節(jié)奏的加快及我國老齡化人口比例的不斷攀升，其患者人數(shù)也呈逐漸上升趨勢。由于該病較高的人群發(fā)生率及其慢性病程給病患帶來的巨大痛苦，國內(nèi)外的很多學(xué)者從病因、發(fā)病機(jī)制、診斷治療及遠(yuǎn)期預(yù)后等諸多方面對其進(jìn)行了有益的探索。
　　

2、對于椎間盤的解剖結(jié)構(gòu)，它是由位于上下兩端的椎間盤軟骨終板、中央?yún)^(qū)域的髓核、環(huán)狀包繞外周的的纖維環(huán)等三部分組成的一個封閉的血供較差的軟骨樣組織。作為承擔(dān)連接相鄰椎體的重要部分，其功能的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)的完整性對于緩沖機(jī)體外部生物負(fù)荷及維持機(jī)體內(nèi)部力學(xué)穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的作用。從椎間盤的病理生理與解剖學(xué)角度來看，在椎間盤纖維環(huán)、髓核、軟骨終板、椎體、黃韌帶、小關(guān)節(jié)的退變的諸多學(xué)說中，由髓核細(xì)胞退變所導(dǎo)致的腰椎退行性疾病是目前被很多學(xué)者所接受的導(dǎo)

3、致該疾患的重要病因。
　　髓核是位于椎間盤中央偏右的呈膠凍狀的組織，它由纖維母細(xì)胞和軟骨樣細(xì)胞這兩種細(xì)胞及大量的小分子彈性粘糖蛋白、水分等細(xì)胞外基質(zhì)所構(gòu)成。兒童時期的椎間盤纖維環(huán)與中心區(qū)域的髓核界限清楚，伴隨著年齡的增長，髓核內(nèi)的水分與彈性粘糖蛋白含量會減低、髓核與纖維環(huán)內(nèi)層的分界會變的模糊不清，髓核組織會變得發(fā)白而堅(jiān)硬。而椎間盤內(nèi)含水量的比例和多寡將直接影響椎間盤的彈性狀態(tài)及其盤內(nèi)的壓力水平，最終會導(dǎo)致椎間盤的生物力學(xué)性質(zhì)發(fā)生改

4、變。在輕微的外界應(yīng)力（例如打噴嚏、彎腰）或長期腰部不均衡外力等因素作用下，很容易導(dǎo)致腰椎間盤突出，從而導(dǎo)致腰部及下肢等一系列相應(yīng)的臨床癥狀的出現(xiàn)。
　　關(guān)于腰椎間盤突出癥的治療方法有很多種，歸納起來主要包括傳統(tǒng)的保守治療、手術(shù)治療和以組織工程等為代表的三大類治療策略。保守治療適用于腰部或下肢疼痛及麻木感不顯著的患者，主要的治療手段有臥床休息、物理牽引、按摩以及服用非甾體類抗炎藥物塞來昔布等。但如果經(jīng)正規(guī)的保守治療三個月或半年后無明

5、顯效果，那么手術(shù)則成為目前臨床主要的治療手段。手術(shù)療法包括傳統(tǒng)的腰椎間盤髓核切除術(shù)及近年新興的微創(chuàng)手術(shù)方式兩大類，通過手術(shù)，將退變突出的髓核組織摘除，實(shí)現(xiàn)解除或緩解突出物對神經(jīng)根或馬尾神經(jīng)壓迫的目的。關(guān)于微創(chuàng)與標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)方法的優(yōu)劣，目前還一直存在諸多爭議。上世紀(jì)末，隨著組織工程技術(shù)等新興學(xué)科的興起，利用細(xì)胞移植等技術(shù)手段從根本上延緩髓核細(xì)胞退變或直接體外構(gòu)建人工椎間盤等策略讓科研工作者重新看到了解決這一臨床難題的曙光。椎間盤細(xì)胞移植治療是

6、一種新興的治療手段，通過細(xì)胞移植，可以使椎間盤內(nèi)的細(xì)胞總量得到增加，從而實(shí)現(xiàn)椎間盤內(nèi)蛋白聚糖及膠原蛋白含量的升高的目的，這被認(rèn)為是能夠延緩椎間盤退變的一種有效的治療方法。對于細(xì)胞移植的種子細(xì)胞來源，自體的未退變髓核細(xì)胞由于無排異反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)而被公認(rèn)為是最為理想的種子細(xì)胞來源之一，但由于自身髓核細(xì)胞數(shù)目較少且是一種有創(chuàng)的操作方式而限制了其應(yīng)用。而來自術(shù)中的取自椎間盤退變性疾病患者的髓核細(xì)胞又存在細(xì)胞活力不足等一些弊端。因此，尋找到一種合適而

7、正確的種子細(xì)胞就成為亟需解決的問題。
　　方法:
　　本實(shí)驗(yàn)的的軟骨終板干細(xì)胞(Cartilage Endplate Stem Cells，CESCs)和髓核細(xì)胞(Nucleus pulposus cells，NPCs)取自15例因退變性腰椎疾患而行腰椎椎間盤切除椎弓根螺釘內(nèi)固定的患者。通過低熔點(diǎn)瓊脂糖懸浮培養(yǎng)法獲得軟骨終板干細(xì)胞的克隆，經(jīng)免疫熒光技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行干細(xì)胞表面標(biāo)記檢測，利用擴(kuò)增出的第三代軟骨終板干細(xì)胞與第

8、一代髓核細(xì)胞進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)共分為三組:單獨(dú)CESCs組、單組退變NPCs培養(yǎng)組、CESCs與退變NPCs共培養(yǎng)組。在實(shí)驗(yàn)開始后的第3、5、7天，利用熒光實(shí)時定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)檢測各個組中Ⅱ型膠原蛋白、SOX-9和聚集蛋白聚糖（Aggrecan，Agc）的mRNA表達(dá)變化情況;在共培養(yǎng)的第七天，采用蛋白免疫印跡技術(shù)(Western-blot)檢測各組細(xì)胞中蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白、Sox-9蛋白的表達(dá)變化

9、，利用流式細(xì)胞儀檢測共培養(yǎng)對髓核細(xì)胞凋亡率的影響;利用CCK-8檢測共培養(yǎng)對髓核細(xì)胞增殖能力的影響。
　　結(jié)果:
　　從所取標(biāo)本中進(jìn)行軟骨終板干細(xì)胞及退變髓核細(xì)胞的分離、鑒定及培養(yǎng)，經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)分析，經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖懸浮培養(yǎng)法篩選出的為軟骨終板干細(xì)胞，RT-PCR檢測顯示，在共培養(yǎng)后，單獨(dú)培養(yǎng)的CESCs在各個時間點(diǎn)幾乎均未檢測到CollⅡ，SOX-9及Agc的表達(dá);共培養(yǎng)組中的CESCs在共培養(yǎng)的第五天開始出現(xiàn)CollⅡ，

10、SOX-9及Agc表達(dá)，與單獨(dú)培養(yǎng)的CESCs相應(yīng)基因表達(dá)量相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);同樣地，共培養(yǎng)組中的NPCs的CollⅡ，SOX-9及Agc等基因的表達(dá)量高于NPCs單獨(dú)培養(yǎng)組(p＜0.05);其表達(dá)量隨著共培養(yǎng)時間延長逐漸升高;在共培養(yǎng)的第七天，利用Western-blot技術(shù)檢測出的各組細(xì)胞中蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白、Sox-9蛋白的表達(dá)變化與RT-PCR檢測結(jié)果一致。通過共培養(yǎng)，使髓核細(xì)胞的凋亡率降低，增殖能力增強(qiáng)。