三維共培養(yǎng)兔髓核細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：平面及三維培養(yǎng)髓核細(xì)胞的生物學(xué)特性
　　 目的：運(yùn)用藻酸鈉微球(alginate beads)培養(yǎng)法和平面培養(yǎng)法對(duì)兔椎間盤髓核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，研究其體外生物學(xué)特性。
　　 方法：4月齡健康新西蘭大耳白兔6只，取髓核細(xì)胞(nucleus pulposus cells，NPCs)原代培養(yǎng)，傳代后分為藻酸鈉微球培養(yǎng)組（實(shí)驗(yàn)組）和平面培養(yǎng)組（對(duì)照組），通過(guò)倒置相差顯微鏡對(duì)髓核細(xì)胞進(jìn)行

2、形態(tài)學(xué)觀察，MTT法測(cè)定兩組髓核細(xì)胞增殖情況，運(yùn)用RT－PCR技術(shù)檢測(cè)兩組髓核細(xì)胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達(dá)。
　　 結(jié)果：經(jīng)過(guò)兩周的培養(yǎng)，兩組髓核細(xì)胞增殖率無(wú)明顯差異，藻酸鈉微球培養(yǎng)組在Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達(dá)上均高于平面培養(yǎng)組 (P<0.05)。
　　 結(jié)論：藻酸鈉微球培養(yǎng)法能促進(jìn)髓核細(xì)胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達(dá)，在維持其表型穩(wěn)定方面優(yōu)于平面培養(yǎng)法。
　　 第二部分：體外誘導(dǎo)標(biāo)記綠色熒光蛋白兔骨

3、髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成骨及成脂的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標(biāo)記兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，觀察其誘導(dǎo)成骨及成脂多向分化的潛能。
　　 方法：取四月齡新西蘭大白兔6只，雌雄不限，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法從兔股骨中分離、純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并在體外進(jìn)行培養(yǎng)，以形態(tài)

4、學(xué)及細(xì)胞表面標(biāo)志的方法鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)特征。用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將綠色熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。利用成骨誘導(dǎo)劑和成脂誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨及成脂方向分化，采用茜素紅染色及油紅O染色檢測(cè)MSCs分化的情況。
　　 結(jié)果：經(jīng)原代及傳代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多呈紡錘形或梭形，成纖維細(xì)胞樣，流式細(xì)胞儀分析MSCsCD44表達(dá)陽(yáng)性，CD34表達(dá)陰性。標(biāo)

5、記綠色熒光蛋白的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)21 d后有較多的鈣鹽沉積，茜素紅染色呈紅色。成脂誘導(dǎo)3天后，細(xì)胞內(nèi)有小脂滴出現(xiàn)，2 周后脂滴數(shù)量增加并相互融合，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形或多邊形，油紅O染色顯示細(xì)胞含有豐富的脂肪顆粒。
　　 結(jié)論：通過(guò)密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法可大量擴(kuò)增、純化MSCs，用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將綠色熒光蛋白質(zhì)粒標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后具有多向分化潛能。
　　 第三部分：三維共培養(yǎng)兔髓核細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓

6、間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：研究髓核細(xì)胞(nucleus pulposus cells，NPCs)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在藻酸鹽微球構(gòu)建的三維環(huán)境下進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，髓核細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的近距離接觸后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型的變化，為構(gòu)建組織工程髓核提供種子細(xì)胞建立基礎(chǔ)。
　　 方法；自健康新西蘭大耳白兔取髓核細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)；將傳代分離純

7、化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)進(jìn)行標(biāo)記并隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組；將轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)（對(duì)照組）或以1：1的比例和髓核細(xì)胞于海藻酸鹽凝膠微球中進(jìn)行共培養(yǎng)（實(shí)驗(yàn)組）；共培養(yǎng)14天后，溶解海藻酸鹽凝膠珠，通過(guò)流式分選收集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并分別利用RT－PCR技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中Ⅱ型膠原（II Collagen）和聚集蛋白聚糖（Aggrecan）的表達(dá)。
　　 結(jié)果；實(shí)驗(yàn)組骨髓間