中華鱉兩株氣單胞菌外膜蛋白及IL-8的克隆與表達(dá).pdf

1、中華鱉(Chinese sofishell turtle,Pelodiscus sinensis or Trionyx sinensis)是我國的重要經(jīng)濟(jì)型水產(chǎn),其鮮美的肉質(zhì)和豐富的營養(yǎng)廣受國內(nèi)外消費(fèi)者的青睞。但近幾年中華鱉病原性疾病大量爆發(fā),給我國養(yǎng)鱉業(yè)造成了重大損失。因此,中華鱉病原性疾病的預(yù)防和冶療成為我國養(yǎng)鱉業(yè)的首要問題。
　　本課題從特異性免疫和非特異性免疫兩方面對中華鱉病原性疾病的防治進(jìn)行探索性研究。特異性免疫方面從中

2、華鱉致病菌嗜水氣單胞菌HBNUAh01和維隆氣單胞菌HBJY01中分別克隆外膜蛋白A基因并分別于煙草葉片細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)和檢測。分別以嗜水氣單胞菌HBNUAh01和維隆氣單胞菌HBJY01為模板進(jìn)行嗜水氣單胞菌外膜蛋白A(AhompA)和維隆氣單胞菌外膜蛋白AⅡ(AvompAⅡ)基因片段的PCR擴(kuò)增,并將其分別克隆到pEASY-Blunt Simple載體中以進(jìn)行測序。測序正確的AhompA和AvompAⅡ基因序列分別與含有黃色熒光蛋白(

3、yellow fluorescent protein,YFP)基因的表達(dá)載體pCAMBIA1300構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受態(tài)細(xì)胞中,隨后用陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)染煙草葉片細(xì)胞。使用激光掃描共聚焦成像系統(tǒng)(Confocal Laser Scanning Microscope)分別檢測觀察融合表達(dá)AhompA和AvompAⅡ基因的黃色熒光蛋白并采用RT-PCR檢測

4、AhompA和AvompAⅡ基因在煙草葉片中的轉(zhuǎn)錄情況。最終從嗜水氣單胞菌HBNUAh01中克隆出大小為1032bp的AhompA基因序列,從維隆氣單胞菌HBJY0l中克隆出大小為996bp的AvompAⅡ基因序列,并在煙草葉片中分別成功表達(dá)AhompA和AvompAⅡ與YFP的融合蛋白。AhompA和AvompAⅡ基因在煙草葉片細(xì)胞中的成功表達(dá)為進(jìn)一步研究利用植物疫苗防治嗜水氣單胞菌和維隆氣單胞菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病奠定了基礎(chǔ)。

5、　　非特異性免疫方面從中華鱉肝臟組織中分別克隆出中華鱉白介素8成熟肽(Psil-8(m))與中華鱉白介素8前體肽(Psil-8)基因并分別于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá),并于檢測純化后對中華鱉中性粒細(xì)胞進(jìn)行趨化性實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證蛋白功能活性。利用信號(hào)肽預(yù)測軟件Signal P3.0對中華鱉白介素8蛋白序列(ACCESSION:ACP28490)進(jìn)行信號(hào)肽定位分析,根據(jù)信號(hào)肽分析結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物分別從中華鱉肝臟組織中擴(kuò)增出Psil-8(m)和P

6、sil-8基因片段。并將其分別克隆到pMD19-T Simple載體中以進(jìn)行測序。測序正確的Psil-8(m)和Psil-8基因分別與表達(dá)載體pET-25b構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受念細(xì)胞中,經(jīng)SDS-PAGE分析IPTG誘導(dǎo)陽性轉(zhuǎn)化子表達(dá)情況后,使用Ni-NTA親和層析柱純化目的蛋白并進(jìn)行Western Blot檢測。隨后將純化后的蛋白用于對中華鱉中性粒細(xì)胞的趨化性實(shí)驗(yàn)以檢測其活性。最終從中華

7、鱉肝臟組織中克隆出大小為246bp的Psil-8(m)基因片段和大小為312bp的Psil-8基因片段,并在大腸桿菌BL21(DE3)@成功表達(dá)Psil-8(m)和Psil-8目的蛋白,純化后的Psil-8(m)和Psil-8在濃度為0.9-1.35μg/μL范圍內(nèi)對中華鱉中性粒細(xì)胞的趨化指數(shù)最高,其中Psil-8(m)最高趨化指數(shù)為3.710,Psil-8最高趨化指數(shù)為2.634,且二者趨化指數(shù)均在濃度小于0.9μg/μL大于1.35