基因重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶的制備與性質(zhì)表征.pdf

1、蛇毒類凝血酶屬于纖維蛋白原裂解酶，是一種絲氨酸蛋白酶。它們降解纖維蛋白原但不激活凝血因子FactorⅩⅢ，形成的纖維蛋白塊能被后繼的血液纖溶系統(tǒng)清除。由于它們在血漿中能夠降低纖維蛋白原，可以作為抗凝劑使用。從珍稀樹棲毒蛇——大連蛇島蝮蛇(Gloydius shedaoensis)毒液中分離制備的蛇毒類凝血酶制品已經(jīng)在血栓病臨床治療應(yīng)用了很多年?？墒氰b于國家法律法規(guī)禁止捕蛇，天然酶生產(chǎn)面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，因而基因工程方法是解決這一困境的最佳選

2、擇之一。本論文內(nèi)容主要就獲得可溶性、活性重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶的制備，尤其是其纖維蛋白原裂解活性開展研究工作。 (一)在大腸桿菌體系中可溶、活性大連蛇島蝮蛇類凝血酶的克隆與表達(dá) 使用Wilkinson-Harrison蛋白質(zhì)可溶性概率模型，對帶有不同商業(yè)化融合標(biāo)簽的重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶的可溶性趨勢進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示在N端融合有NusA、GST和TrxA的重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶具有更高的可溶性。因而選擇NusA

3、、GST和TrxA三種標(biāo)簽用于促進(jìn)大連蛇島蝮蛇類凝血酶在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。相應(yīng)地，構(gòu)建了pQYNusA-glo-a、pQYGST-Glo-a和pQYTrxA-Glo-a三種表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化獲得了相應(yīng)的大腸桿菌BL21-Gold(DE3)重組菌株。SDS-PAGE分析和Westernblotting檢測確定pQYNusA-Glo-a的可溶性表達(dá)狀況最佳。 (二)重組蛇毒類凝血酶的分離純化 1、首次使用人工核酸酶R5

4、對重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶樣品預(yù)處理：在400nm紫外光激發(fā)條件下，1mMR5可以高效去除重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶樣品中的核酸雜質(zhì)，而對重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶的活力沒有造成損傷。由于合成成本低，人工核酸酶R5在蛋白質(zhì)/酶的生產(chǎn)中具有很好的應(yīng)用前景。 2、采用四步柱層析方法獲得高純度重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶：柱層析依次包括PhenylSepharoseFF疏水層析、QSepharoseHP陰離子交換層析、MonoQ高分辨陰離子

5、交換層析和Superdex200分子排阻層析，最終獲得重組蛇島蝮蛇類凝血酶在SDS-PAGE膠上呈現(xiàn)單一條帶，產(chǎn)率為0.1mg/L。其表觀分子量90kDa，比活力為506U/mg。 (三)重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶的生化性質(zhì)表征： 1、重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶酶學(xué)性質(zhì)：具有纖維蛋白原凝結(jié)活性、纖維蛋白原裂解活性以及酰胺水解活性。以酰胺水解活性底物BApNA為模式底物，該酶催化活性最適溫度為40℃，最適pH為8.0。重組

6、酶對纖維蛋白原裂解呈現(xiàn)劑量依賴和時(shí)間依賴，其裂解方式為：優(yōu)先裂解Aα-鏈，然后裂解Bβ-鏈，但不裂解γ-鏈。 2、抑制劑對酰胺水解酶活力的影響：研究了多種絲氨酸蛋白酶抑制劑、螯合劑、還原劑及凝血酶抑制劑對重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶的影響。絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF(1mM)和TPCK(1mM)分別抑制了重組酶100％和77％的酰胺水解活力，表明它屬于絲氨酸蛋白酶家族。抑制劑苯脒、3-氨基苯脒、4-氨基苯脒和咪唑只抑制了<15％酶

7、活力。EDTA不影響酰胺水解活力，表明大連蛇島蝮蛇類凝血酶不是金屬依賴型蛋白水解酶。還原劑二硫蘇糖醇和β-巰基乙醇對酶活力沒有影響，表明重組酶具有高度穩(wěn)定性。凝血酶天然抑制劑如肝素等，不影響重組酶的酰胺水解活力，表明重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶與凝血酶在結(jié)構(gòu)上存在差異。 3、抑制劑對纖維蛋白原裂解酶活力的影響：通過SDS-PAGE的方法，研究了絲氨酸蛋白酶抑制劑、螯合劑、還原劑及凝血酶抑制劑對重組酶纖維蛋白原裂解活性的影響。絲氨酸

8、蛋白酶抑制劑中只有PMSF具有抑制作用，表明Ser182既是酰胺水解活性又是纖維蛋白原裂解活性的關(guān)鍵氨基酸催化殘基。同源模建預(yù)測表明PMSF與Ser182之間形成共價(jià)鍵阻礙了底物分子的趨近?？墒荰PCK只影響了酰胺水解活力，卻對纖維蛋白原裂解活力沒有影響。EDTA阻礙了重組酶的纖維蛋白原裂解活力，提示金屬離子尤其是過渡金屬離子在纖維蛋白原裂解過程發(fā)揮了作用。EDTA的抑制作用可能與EDTA螯合去除痕量金屬離子從而引起底物纖維蛋白原的構(gòu)象

9、改變有關(guān)。還原劑二硫蘇糖醇和β-巰基乙醇不抑制酰胺水解活力，表明重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶的高穩(wěn)定性。肝素和水蛭素不影響纖維蛋白原裂解活力，提示重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶可與肝素或水蛭素聯(lián)合應(yīng)用于肝素相關(guān)血小板減少癥和心肺血栓疾病的臨床治療。 4、金屬離子對酰胺水解活性和纖維蛋白原裂解活性的影響： 1)1mM過渡金屬離子對重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶酰胺水解活力產(chǎn)生抑制的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篎e2+>Cu2+≈Zn2+>Hg2+>>

10、Ni2+，EDTA的引入可以恢復(fù)>80％被過渡金屬離子抑制的重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶酰胺水解活力；其他金屬離子Co2+和Mn2+分別抑制了重組酶酰胺水解活力的38％和25％；2)過渡金屬離子抑制重組酶的纖維蛋白原裂解活力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篊u2+≈Ni2+>Zn2+>Co2+；其他二價(jià)金屬離子如Ca2+和Mg2+對兩種活力都沒有影響。根據(jù)Irving-Williams晶體場理論，結(jié)合同源模建獲得的大連蛇島蝮蛇類凝血酶模型，抑制效應(yīng)的產(chǎn)生可能

11、和Zn2+與酶催化中心Ser182側(cè)鏈上O原子、His43咪唑環(huán)上N原子以及兩分子H2O中O原子之間形成四對配位鍵有關(guān)。 綜上，本研究通過在目標(biāo)蛋白N端融合NusA標(biāo)簽的表達(dá)策略，獲得了重組蛇島蝮蛇類凝血酶可溶性、活性表達(dá)；人工核酸酶R5可以高效地去除重組大連蛇島蝮蛇類凝血酶粗樣品中的核酸雜質(zhì)，并對重組酶活力沒有損傷，表明人工核酸酶R5在生化工程領(lǐng)域中具有很好的應(yīng)用潛力；利用四步柱層析純化獲得了高純度的可溶性重組大連蛇島蝮蛇類