蛇毒類凝血酶的純化與基因篩選.pdf

1、研究目的：
　　血管損傷性止血在臨床上占有很大比例。蛇毒酶制劑作為臨床用藥與同類其它制劑相比,其效果優(yōu)良,無(wú)嚴(yán)重的副作用,使用安全,在臨床治療上有很好的發(fā)展前景。國(guó)內(nèi)關(guān)于蛇毒類凝血酶酶的研究和利用有很多報(bào)道,但是真正具有國(guó)內(nèi)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的止血用蛋白質(zhì)還沒(méi)有,同時(shí)也存在蛇毒原料的限制。在過(guò)去8年里,我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的止血蛋白Agacutase,其含量非常低,因此,本課題對(duì)尖吻蝮蛇蛇毒的止血類凝血酶進(jìn)行分離純化和基因篩選,通過(guò)基因重組生產(chǎn)

2、,降低生產(chǎn)成本和促進(jìn)產(chǎn)品升級(jí)打下了基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　本研究自尖吻蝮蛇蛇毒純化一種新的具有凝血活性的類凝血酶 Agacutase。通過(guò)用Sephadex G-75凝膠層析、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和Sephadex G-25凝膠脫鹽分離純化,根據(jù)核酸蛋白檢測(cè)儀在 A280的檢測(cè)值大小,收集不同組分。用SDS-PAGE、HPLC檢驗(yàn)其純度,用質(zhì)譜(MS)和凝血活性方法,對(duì)其分子量和對(duì)

3、底物酶解活性進(jìn)行分析。
　　在設(shè)計(jì)上游引物時(shí),我們根據(jù)純化得到Agacutase的蛋白測(cè)序知道的前44位氨基酸序列來(lái)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。運(yùn)用M13(-48)作下游引物,是為了在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)在oligo dT前面加上一段便于測(cè)序的基因,以蛇毒腺總RNA為模板,用RT-PCR方法擴(kuò)增其中的類凝血酶基因序列,膠回收條帶并克隆至T載體上,通過(guò)雙向測(cè)序得到篩選類凝血酶基因目的。通過(guò)用美國(guó)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)克隆的蛇毒基因進(jìn)行同源性分析研究,以獲得初步

4、的功能信息。
　　研究結(jié)果：
　　通過(guò)對(duì)蛇毒干粉進(jìn)行多步分離純化后,用HPLC檢測(cè)其純度在90％以上,SDS-PAGE電泳結(jié)果為只有單一條帶,基體輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)檢測(cè)結(jié)果分子量為31084 Da。纖維蛋白原底物分子水解活性顯示,樣品對(duì)α亞基逐步水解,在3小時(shí)水解達(dá)到高峰,而對(duì)照組中的豬凝血酶對(duì)纖維蛋白原的α亞基和β亞基明顯水解,在1小時(shí)達(dá)到高峰。并對(duì)β亞基的水解速度明顯快于對(duì)α亞基的

5、水解速度。
　　通過(guò)設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的簡(jiǎn)并引物(I、II、III、IV和V引物),用RT-PCR方法成功擴(kuò)增出不同大小的片段:I號(hào)引物對(duì)擴(kuò)增出1200bp、800bp、600bp三個(gè)片段;II號(hào)引物對(duì)擴(kuò)增出一個(gè)500bp的片段;III號(hào)引物對(duì)擴(kuò)增出1500bp和750bp兩個(gè)片段;IV號(hào)引物對(duì)擴(kuò)增出一個(gè)750bp的片段;V號(hào)引物對(duì)擴(kuò)增出1200bp和750bp兩個(gè)片段。PCR產(chǎn)物克隆于T載體后,挑取陽(yáng)性克隆,測(cè)序得到六種類凝血酶基因(

6、基因-I、III、VI、VII、VIII和IX)。
　　通過(guò)NCBI的BLAST比對(duì)后,發(fā)現(xiàn)它們分別與以下蛋白酶的氨基酸序列具有一定同源性:基因-I與蛇毒金屬蛋白酶(snake venom metalloproteinase)有最大同源性為50%,后者具有水解纖維蛋白原的α鏈功能;基因-II與活化蛋白激酶C受體(receptor for activated protein kinase C)有最大同源性為21%;基因-III與蛇毒

7、絲氨酸蛋白酶Da-36(snake venom serine protease Da-36)有最大同源性為78%,后應(yīng)具有裂解纖維蛋白原Aα、Bβ和γ鏈的功能;基因-IV與NADH脫氫酶亞基4(NADH dehydrogenase subunit4)有最大同源性為95%;基因-V與rCG20216有最大同源性為77%;基因-VI與蛇毒絲氨酸蛋白酶Dav-PA(Snake venom serine protease Dav-PA)有最大同

8、源性為80%,可能具有裂解纖維蛋白原Aα和Bβ鏈功能;基因-VII與類凝血酶Acutobin(Thrombin-like enzyme acutobin)有最大同源性為95%,應(yīng)具有水解纖維蛋白原的α鏈功能;基因-VIII與蛇種Agkistrodon Acutus類凝血酶(venom thrombin-like enzyme)有最大同源性為60%,可能具有裂解纖維蛋白原Aα和 Bβ鏈功能;基因-IX與蛇種Agkistrodon Acut

9、us的金屬蛋白酶Aahiv的A鏈有最大同源性為55%,可能具有蛇毒金屬蛋白酶的功能。
　　研究結(jié)論：
　　通過(guò)凝膠過(guò)濾層析與離子交換層析等分離純化過(guò)程從尖吻蝮蛇蛇毒干粉中得到單一的組分,該組分為一種新的具有止血活性的類凝血酶,并命名為Agacutase。
　　基因篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了幾種新的蛇毒類凝血酶。根據(jù)DNA序列推導(dǎo)氨基酸序列,通過(guò)NCBI的protein BLAST比對(duì)后,發(fā)現(xiàn)其中6個(gè)與幾種已知序列的類凝血酶的同源性