核酸識體與分子信標(biāo)技術(shù)用于凝血酶檢測的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體的重要組成部分之一。相對于基因檢測，蛋白質(zhì)的檢測也更為直接、準(zhǔn)確，在疾病診斷中起著重要的作用。但是由于傳統(tǒng)研究方法往往需要放射性標(biāo)記、凝膠電泳和放射性自顯影等繁雜操作，在一定程度上限制了人們對這些生命過程的深入研究。因此如何快速、簡單、高效地對蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，已經(jīng)成為需要迫切解決的問題。本文以凝血酶為研究模型，基于核酸識體(aptamer)和分子信標(biāo)(molecularbeacon，MB)技術(shù)發(fā)展蛋白質(zhì)分析的新方法。從

2、該思路出發(fā)，本文開展了以下三方面的研究工作： 1、利用雙發(fā)夾識體探針檢測凝血酶結(jié)合核酸識體和分子信標(biāo)序列，設(shè)計無標(biāo)記的識體探針檢測凝血酶。識體探針呈雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)，存在兩段莖狀分子內(nèi)雜交，分子信標(biāo)的對應(yīng)打開序列被兩個莖部雜交封閉。沒有凝血酶時，分子信標(biāo)會很難被識體探針打開；而有凝血酶存在時，凝血酶可以與識體探針外側(cè)莖部的核酸識體結(jié)合，打開識體探針該部分的莖狀結(jié)構(gòu)，使得識體探針只剩余一個不穩(wěn)定的莖狀結(jié)構(gòu)。此時，識體探針會較易與分子信標(biāo)

3、雜交，使分子信標(biāo)產(chǎn)生明顯上升的熒光信號。通過這種信號的上升程度，達(dá)到檢測凝血酶的目的。該方法檢測靈敏，特異性好。同時用該方法考察了粘多糖類化合物肝素在凝血酶與其抗體作用中的影響，結(jié)果與文獻(xiàn)相符。該方法不但可以擴(kuò)大對其他蛋白質(zhì)檢測的適用性，而且可以考察蛋白質(zhì)與其他相關(guān)分子的作用情況。 2、基于內(nèi)含分子信標(biāo)互補(bǔ)序列的識體探針檢測凝血酶設(shè)計了一種新的無需標(biāo)記的蛋白質(zhì)識體探針，識體探針由核酸識體和分子信標(biāo)互補(bǔ)序列兩部分直接組成。分別利用

4、分子信標(biāo)作為報告分子，核酸識體作為識別分子。沒有凝血酶存在時，識體探針可以和分子信標(biāo)最大程度地雜交，使得分子信標(biāo)的熒光信號上升；當(dāng)存在凝血酶時，與凝血酶孵育結(jié)合后的識體探針再與分子信標(biāo)作用，分子信標(biāo)被打開的程度有所降低，并且打開程度的降低程度與凝血酶濃度有關(guān)。根據(jù)相應(yīng)的熒光信號變化幅度，可以實現(xiàn)凝血酶的快速、靈敏檢測。利用該方法考察了肝素對凝血酶與凝血酶抗體之間相互作用的影響。利用該方法不改變分子信標(biāo)，僅改變識體探針中識體的類別，即可有

5、望用于其他蛋白質(zhì)的檢測，為蛋白質(zhì)的研究方法提供了新的途徑。 3、基于脫氧核糖核酸聚合反應(yīng)的識體探針檢測凝血酶發(fā)展了一種識體探針設(shè)計簡單、無須標(biāo)記，樣品信號明顯、特異性高的凝血酶檢測方法。利用凝血酶異構(gòu)位點1的核酸識體，結(jié)合分子信標(biāo)的互補(bǔ)序列設(shè)計了呈單莖環(huán)狀的識體探針。該識體探針可以產(chǎn)生鏈內(nèi)互補(bǔ)，呈現(xiàn)類似“模板、引物，，的二級結(jié)構(gòu)，滿足聚合反應(yīng)發(fā)生的結(jié)構(gòu)條件。識體探針與分子信標(biāo)雜交產(chǎn)生較大的熒光信號后，在沒有凝血酶參與時，識體探針