重組雙功能水蛭素結(jié)構(gòu)與功能研究及新型直接凝血酶抑制劑的設(shè)計.pdf

1、隨著人們生活水平的不斷提高及社會老齡化問題的日益嚴重，心腦血管血栓性疾病發(fā)病率和致死率非常高，是中老年人的常見病和多發(fā)病，嚴重威脅人類的健康。臨床上常見的急性心肌梗塞、腦血栓和彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)多數(shù)為動脈血栓，是致死或致殘的主要原因之一;血液凝固異常是這一類疾病的發(fā)生、蔓延及干預(yù)中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。
　　血栓性疾病在急性發(fā)病前需及早干預(yù)治療，發(fā)病后經(jīng)溶栓治療，需要長期用藥，預(yù)防血栓再次形成而復發(fā)。肝素和維生素K是臨床上常用的

2、抗凝治療藥物，已有近百年的歷史。然而，在臨床使用過程中，不斷地發(fā)現(xiàn)肝素、維生素K等用于抗凝治療時會引發(fā)不良反應(yīng)，限制了它們的使用范圍。而凝血酶作為血液凝固的關(guān)鍵因子，成為臨床上預(yù)防血栓形成的重要靶點。
　　水蛭素是特異性的凝血酶抑制劑，并且是一種直接凝血酶抑制劑(directthrombin inhibitors，DTIs)，臨床上用于防治血栓疾病，有著重要的應(yīng)用價值。我們實驗室研制、開發(fā)了重組雙功能水蛭素(RGD-Hirudin

3、)，中國發(fā)明專利“一種新型雙功能水蛭素及其制備方法和應(yīng)用”已授權(quán)，專利號:ZL01105798.X。RGD-Hirudin是在野生型水蛭素分子的合理部位融合了Arg-Gly-Asp(RGD)三肽，使這種水蛭素衍生物既保留了抗凝血酶活性，又增加了抑制血小板聚集的活性，具有降低血黏度，抗栓、防栓等作用。經(jīng)過藥效學研究證明用于血管吻合術(shù)后抗凝治療，療效優(yōu)于野生型水蛭素和肝素。但是RGD-Hirudin是一種蛋白質(zhì)/多肽類藥物，只能通過靜脈注射

4、的給藥方式用藥，臨床應(yīng)用范圍有限。
　　目前，已有四種注射用DTIs及一種口服DTI成功用于臨床。然而，這些藥物的臨床適應(yīng)癥狀單一，每種DTI都針對特定的病癥，且治療費用昂貴。所以，開發(fā)新型DTIs（包括注射和口服給藥方式）無論在治療和預(yù)防血栓栓塞疾病方面還是在經(jīng)濟效益方面都具有極為廣闊的前景。
　　本項研究的主要目的是從重組雙功能水蛭素的結(jié)構(gòu)和功能研究入手，發(fā)現(xiàn)其與凝血酶相互作用的重要位點，闡明兩者相互作用機制，對雙功能水

5、蛭素作進一步的改造，設(shè)計和研制具有抗凝活性的小分子多肽，用于開發(fā)口服或皮下注射的抗凝防栓藥物。
　　本論文研究內(nèi)容主要包括四個部分:
　　1.利用畢赤酵母表達系統(tǒng)，通過高密度發(fā)酵的方法，采用適當純化方案，以13C甘油、13C甲醇分別為生長階段和誘導階段提供碳源;以15N硫酸銨為氮源，對RGD-hirudin作15N/13C均一標記，經(jīng)發(fā)酵和純化，獲得15N/13C全標記RGD-hirudin，對其純度、分子量及生物學活性進行

6、了鑒定，為深入開展構(gòu)效關(guān)系研究打下了良好的基礎(chǔ)。
　　2.利用多維核磁共振技術(shù)，對15N/13C均一標記的RGD-hirudin作了1D1H譜，3D CBCA(CO)NH譜，3D CBCANH譜，3D HNCO譜，2D1H-15N HSQC譜的測定，并對骨架共振信號進行了歸屬指認。利用化學位移擾動實驗研究了15N/13C均勻標記的RGD-hirudin與凝血酶的相互作用位點，明確了RGD-himdin的關(guān)鍵氨基酸殘基位點。

7、　　3.利用同源建模的方法模擬了RGD-hirudin的全長結(jié)構(gòu)，通過分子對接的方法得到RGD-hirudin與凝血酶復合物的模型結(jié)構(gòu)，結(jié)合NMR化學位移擾動實驗的結(jié)果，對RGD-hirudin與凝血酶的相互作用進行了深入的分析。為了驗證復合體模型的準確性，進一步對兩者相互作用過程中，與凝血酶形成氫鍵的RGD-hirudin氨基酸殘基進行了虛擬丙氨酸掃描，分析突變體穩(wěn)定性及合理性。利用重組DNA技術(shù)，將計算機模擬得到的關(guān)鍵氨基酸殘基作丙

8、氨酸單點突變，獲得了6個RGD-hirudin的突變體。測定了這些突變體的抗凝活性和抗血小板聚集的活性;利用表面等離子共振實驗(SPR)分別測定了RGD-hirudin和這些突變體與凝血酶相互作用的親和力。確認RGD-hirudin與凝血酶相互作用關(guān)系，即RGD-hirudin的C-末端與凝血酶exositesⅠ結(jié)合，N-末端與凝血酶活性位點結(jié)合，抑制凝血酶活性。
　　4.基于RGD-hirudin的結(jié)構(gòu)功能研究結(jié)果，以RGD-h