重組雙功能水蛭素結(jié)構(gòu)與功能研究及新型直接凝血酶抑制劑的設(shè)計(jì).pdf

1、隨著人們生活水平的不斷提高及社會(huì)老齡化問(wèn)題的日益嚴(yán)重，心腦血管血栓性疾病發(fā)病率和致死率非常高，是中老年人的常見(jiàn)病和多發(fā)病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。臨床上常見(jiàn)的急性心肌梗塞、腦血栓和彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)多數(shù)為動(dòng)脈血栓，是致死或致殘的主要原因之一;血液凝固異常是這一類(lèi)疾病的發(fā)生、蔓延及干預(yù)中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。
　　血栓性疾病在急性發(fā)病前需及早干預(yù)治療，發(fā)病后經(jīng)溶栓治療，需要長(zhǎng)期用藥，預(yù)防血栓再次形成而復(fù)發(fā)。肝素和維生素K是臨床上常用的

2、抗凝治療藥物，已有近百年的歷史。然而，在臨床使用過(guò)程中，不斷地發(fā)現(xiàn)肝素、維生素K等用于抗凝治療時(shí)會(huì)引發(fā)不良反應(yīng)，限制了它們的使用范圍。而凝血酶作為血液凝固的關(guān)鍵因子，成為臨床上預(yù)防血栓形成的重要靶點(diǎn)。
　　水蛭素是特異性的凝血酶抑制劑，并且是一種直接凝血酶抑制劑(directthrombin inhibitors，DTIs)，臨床上用于防治血栓疾病，有著重要的應(yīng)用價(jià)值。我們實(shí)驗(yàn)室研制、開(kāi)發(fā)了重組雙功能水蛭素(RGD-Hirudin

3、)，中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利“一種新型雙功能水蛭素及其制備方法和應(yīng)用”已授權(quán)，專(zhuān)利號(hào):ZL01105798.X。RGD-Hirudin是在野生型水蛭素分子的合理部位融合了Arg-Gly-Asp(RGD)三肽，使這種水蛭素衍生物既保留了抗凝血酶活性，又增加了抑制血小板聚集的活性，具有降低血黏度，抗栓、防栓等作用。經(jīng)過(guò)藥效學(xué)研究證明用于血管吻合術(shù)后抗凝治療，療效優(yōu)于野生型水蛭素和肝素。但是RGD-Hirudin是一種蛋白質(zhì)/多肽類(lèi)藥物，只能通過(guò)靜脈注射

4、的給藥方式用藥，臨床應(yīng)用范圍有限。
　　目前，已有四種注射用DTIs及一種口服DTI成功用于臨床。然而，這些藥物的臨床適應(yīng)癥狀單一，每種DTI都針對(duì)特定的病癥，且治療費(fèi)用昂貴。所以，開(kāi)發(fā)新型DTIs（包括注射和口服給藥方式）無(wú)論在治療和預(yù)防血栓栓塞疾病方面還是在經(jīng)濟(jì)效益方面都具有極為廣闊的前景。
　　本項(xiàng)研究的主要目的是從重組雙功能水蛭素的結(jié)構(gòu)和功能研究入手，發(fā)現(xiàn)其與凝血酶相互作用的重要位點(diǎn)，闡明兩者相互作用機(jī)制，對(duì)雙功能水

5、蛭素作進(jìn)一步的改造，設(shè)計(jì)和研制具有抗凝活性的小分子多肽，用于開(kāi)發(fā)口服或皮下注射的抗凝防栓藥物。
　　本論文研究?jī)?nèi)容主要包括四個(gè)部分:
　　1.利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)高密度發(fā)酵的方法，采用適當(dāng)純化方案，以13C甘油、13C甲醇分別為生長(zhǎng)階段和誘導(dǎo)階段提供碳源;以15N硫酸銨為氮源，對(duì)RGD-hirudin作15N/13C均一標(biāo)記，經(jīng)發(fā)酵和純化，獲得15N/13C全標(biāo)記RGD-hirudin，對(duì)其純度、分子量及生物學(xué)活性進(jìn)行

6、了鑒定，為深入開(kāi)展構(gòu)效關(guān)系研究打下了良好的基礎(chǔ)。
　　2.利用多維核磁共振技術(shù)，對(duì)15N/13C均一標(biāo)記的RGD-hirudin作了1D1H譜，3D CBCA(CO)NH譜，3D CBCANH譜，3D HNCO譜，2D1H-15N HSQC譜的測(cè)定，并對(duì)骨架共振信號(hào)進(jìn)行了歸屬指認(rèn)。利用化學(xué)位移擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)研究了15N/13C均勻標(biāo)記的RGD-hirudin與凝血酶的相互作用位點(diǎn)，明確了RGD-himdin的關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)。

7、　　3.利用同源建模的方法模擬了RGD-hirudin的全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，通過(guò)分子對(duì)接的方法得到RGD-hirudin與凝血酶復(fù)合物的模型結(jié)構(gòu)，結(jié)合NMR化學(xué)位移擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)RGD-hirudin與凝血酶的相互作用進(jìn)行了深入的分析。為了驗(yàn)證復(fù)合體模型的準(zhǔn)確性，進(jìn)一步對(duì)兩者相互作用過(guò)程中，與凝血酶形成氫鍵的RGD-hirudin氨基酸殘基進(jìn)行了虛擬丙氨酸掃描，分析突變體穩(wěn)定性及合理性。利用重組DNA技術(shù)，將計(jì)算機(jī)模擬得到的關(guān)鍵氨基酸殘基作丙

8、氨酸單點(diǎn)突變，獲得了6個(gè)RGD-hirudin的突變體。測(cè)定了這些突變體的抗凝活性和抗血小板聚集的活性;利用表面等離子共振實(shí)驗(yàn)(SPR)分別測(cè)定了RGD-hirudin和這些突變體與凝血酶相互作用的親和力。確認(rèn)RGD-hirudin與凝血酶相互作用關(guān)系，即RGD-hirudin的C-末端與凝血酶exositesⅠ結(jié)合，N-末端與凝血酶活性位點(diǎn)結(jié)合，抑制凝血酶活性。
　　4.基于RGD-hirudin的結(jié)構(gòu)功能研究結(jié)果，以RGD-h