烙鐵頭蛇毒凝血酶原激活酶FVbc的純化及性質(zhì)研究.pdf

1、蛇毒蛋白中存在許多能影響機(jī)體止血系統(tǒng)的蛋白質(zhì)和多肽，這些蛇毒蛋白和多肽主要通過特異性激活prothrombin、FactorX、FactorV、FactorVII等凝血因子，直接凝集纖維蛋白原以及促進(jìn)血小板聚集等方式來促進(jìn)血液凝固。蛇毒凝血酶原激活酶是通過激活凝血酶原生成凝血酶來促進(jìn)血液凝固。迄今為止已經(jīng)從蛇毒中分離純化出多種蛇毒凝血酶原激活酶。烙鐵頭蛇毒的研究主要集中在纖溶活性和抗凝活性方面。然而，對(duì)促凝活性組分的分離純化及性質(zhì)研究的

2、報(bào)道卻很少，目前也沒有烙鐵頭凝血酶原激活酶被開發(fā)應(yīng)用于臨床。
　　 目的：
　　 本課題從湖南產(chǎn)烙鐵頭的蛇毒干粉中探尋一個(gè)能夠促進(jìn)血液凝固的蛋白分子，著力研究其理化性質(zhì)、生物活性、酶學(xué)特征及促凝血作用機(jī)制等相關(guān)內(nèi)容。
　　 方法：
　　 1.利用CM-Sephadex C-50陽離子交換層析，SP Sepharose High Performance陽離子交換層析及Blue Sepharose6 Fast

3、 Flow親和凝膠層析這三步分離純化技術(shù)，從烙鐵頭蛇毒的粗毒中分離純化目的產(chǎn)物FVbc；
　　 2.利用SDS-PAGE鑒定FVbc的純度；
　　 3.利用MALDI-4800-TOF-TOF質(zhì)譜儀測(cè)定FVbc的分子量；
　　 4.利用等電聚焦電泳法測(cè)定FVbc的等電點(diǎn)；
　　 5.采用Edman降解法測(cè)定FVbc的N端序列，再利用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Bla

4、st.cgi系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)N端序列同源性比對(duì)；
　　 6.采用R.Rajesh和Williams的方法把FVbc與PPP相互作用，研究FVbc對(duì)PPP的體外凝固作用；以凝血酶為參照品研究FVbc的體外凝血活力；
　　 7.采用Rong Gao和Manjunatha的方法，配置FVbc與纖維蛋白原溶液相互作用的反應(yīng)體系，在37℃下溫育，研究FVbc對(duì)纖維蛋白原的直接凝固作用；
　　 8.采用特異性顯色底物法，配置F

5、Vbc與凝血酶原相互作用的反應(yīng)體系和FVbc與凝血因子X相互作用的反應(yīng)體系，在37℃下溫育，然后將各反應(yīng)體系與各自特異性顯色底物相互作用，研究FVbc對(duì)凝血酶原和凝血因子X的激活作用；
　　 9.配置FVbc與凝血酶原相互作用的反應(yīng)體系，在37℃下溫育，通過SDS-PAGE研究FVbc對(duì)凝血酶原的降解作用；
　　 10.采用特異性顯色底物法測(cè)定不同溫度、不同PH、不同濃度鈣離子以及不同金屬離子對(duì)FVbc酶活性的影響；

6、r>　　 11.配置FVbc與抑制劑相互作用反應(yīng)體系，在37℃下溫育15min后，接著將反應(yīng)體系與凝血酶原相互作用，在37℃下溫育5min，再通過SDS-PAGE研究不同抑制劑對(duì)FVbc酶活性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.烙鐵頭蛇毒經(jīng)三步分離純化后得到具有體外促進(jìn)血漿凝固作用的組分FVbc，回收率為0.25％。FVbc為單鏈蛋白質(zhì)，精確分子量為25358.650Da，等電點(diǎn)主帶為5.4，在4.9處有一條弱帶分布，F(xiàn)

7、Vbc的N端10個(gè)氨基酸序列分別為NH2-V-I-G-X-D-E-X-N-I-N；
　　 2.FVbc具有體外凝血活性，凝血活力為1.5NIH U/mg；當(dāng)FVbc的濃度為2mg/ml時(shí)，PPP的凝固時(shí)間為47s左右，F(xiàn)Vbc的體外促凝作用呈現(xiàn)量效關(guān)系；
　　 3.FVbc的濃度為4mg/ml，經(jīng)過12h的觀察，發(fā)現(xiàn)FVbc仍然不能使纖維蛋白原溶液凝固；FVbc與凝血因子X相互作用的反應(yīng)體系不能使FactorXa的特異性

8、顯色底物顯色；FVbc與凝血酶原相互作用的反應(yīng)體系可以使凝血酶的特異性顯色底物顯色，且該作用呈量效、時(shí)效關(guān)系；
　　 4.FVbc能夠水解凝血酶原的Arg322-Ile323肽鍵，生成初級(jí)中間產(chǎn)物Meizothrombin，從而活化凝血酶原生成凝血酶；
　　 5.FVbc的適宜PH為PH5.5-7.5，適宜溫度為30-40℃；FVbc的酶活性呈現(xiàn)非鈣離子依賴性，Ba2+和Mg2+可增強(qiáng)FVbc的酶活性，Cu2+、Zn2+

9、和Ni2+可抑制FVbc的酶活性；金屬蛋白酶抑制劑EDTA和EGTA也可以不同程度的抑制FVbc的酶活性，而絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF、Aprotinin對(duì)FVbc的酶活性沒有影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.烙鐵頭蛇毒的粗毒經(jīng)過CM-Sephadex C-50陽離子交換層析、SP SepharoseHigh Performance陽離子交換層析及Blue Sepharose6 Fast Flow親和凝膠層析的三步分離純化

10、后，最終得到具有促凝作用的目的產(chǎn)物FVbc；FVbc屬于第Ⅰ類蛇毒凝血酶原激活酶。
　　 2.FVbc的精確分子量為25358.650Da，等電點(diǎn)主帶為5.4，在4.9處有一條弱帶分布，其N端10個(gè)氨基酸序列分別為NH2-V-I-G-X-D-E-X-N-I-N；FVbc酶活性的適宜PH為5.5-7.5，適宜溫度為30-40℃。
　　 3.FVbc通過水解凝血酶原的Arg322-Ile323肽鍵激活凝血酶原生成凝血酶，從而