月月桂香精油提取研究及其調(diào)控基因AACT克隆技術(shù).pdf

1、月月桂花香淡雅，微黃，四季開(kāi)花，但其花量少，即使處于盛花階段，花量也比同類(lèi)花量少。月月桂花香是眾多桂花中最淡的，幾乎聞不到花香味，這限制了其觀賞及商業(yè)應(yīng)用。因此雖然桂花香精油廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品產(chǎn)業(yè)，而月月桂精油的提取及商業(yè)應(yīng)用卻不常見(jiàn)。
　　本研究發(fā)現(xiàn)月月桂香氣較淡、香氣成分時(shí)空表達(dá)差異具有較大的缺點(diǎn)，探索月月桂精油提取的最佳工藝，探索月月桂精油工業(yè)化提取的可能性，以月月桂精油提取量為衡量指標(biāo)，優(yōu)化月月桂石油醚萃取法提取工藝，得

2、到最佳的提取條件。針對(duì)月月桂花香較淡的缺點(diǎn)，本研究通過(guò)克隆月月桂乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶(acetyl-CoAC-acetyltransferase，AACT)基因全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并試圖構(gòu)建AACT植物表達(dá)載體，為改善月月桂香氣較淡、香氣成分時(shí)空表達(dá)差異探索一條可行的道路。本文還研究了月月桂時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)，為AACT植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體植物提供理論支撐。實(shí)驗(yàn)的主要結(jié)果如下:
　　1.利用石油醚萃取月月桂香精油，其最佳提取

3、工藝為:粉碎至20目，料液比為1∶5m/v，提取溫度為60℃，提取4h。通過(guò)GC-MS技術(shù)分析檢測(cè)香精油的香型成分，發(fā)現(xiàn)香氣成分以醇類(lèi)、酯類(lèi)、酸類(lèi)等物質(zhì)為主，其中萜類(lèi)物質(zhì)占了85％以上，所有成分中角鯊烯的含量最高，為11.5986％，其中的單帖類(lèi)物質(zhì)如α-蒎烯、β-羅勒烯、水芹烯、莰烯、芳樟醇等的含量達(dá)到16.5957％，而紫羅蘭酮和4-羥基-β-紫羅酮香的含量為12.1328％。
　　2.采用RACE技術(shù)克隆香精油成分的合成關(guān)鍵

4、酶一乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶(AACT)的基因，得到的cDNA序列長(zhǎng)為1580bp，并對(duì)此基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，月月桂AACT開(kāi)放閱讀框在80～1297 bp之間，共編碼405個(gè)氨基酸;相對(duì)分子質(zhì)量為41347.89 D;等電點(diǎn)為5.66，為疏水性穩(wěn)定蛋白，屬Cond-enzymes超家族，氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析都可以發(fā)現(xiàn)，AACT的保守性高，具有可靠性。
　　3.采用AACT基因的半定量表達(dá)分析觀察AACT基因的組織特異性表達(dá)

5、和時(shí)空差異表達(dá)，分析AACT在月月桂花瓣和葉子中不同季度的表達(dá)量水平及不同花期的表達(dá)量。基因表達(dá)半定量分析結(jié)果顯示:春夏秋冬四季中月月桂花瓣中AACT的表達(dá)量相似度達(dá)99％，AACT表達(dá)量均為1.0241左右，上下偏差不超過(guò)0.0201;月月桂葉子中AACT的表達(dá)量隨著季節(jié)的轉(zhuǎn)換逐漸降低，AACT量從3月份的0.7740一直降為0.1200;同一季節(jié)，月月桂花瓣中AACT的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉子中AACT的表達(dá)量，且隨著季節(jié)變化差距越來(lái)越大

6、，3、6、9、12月份月月桂花和葉子的AACT表達(dá)量差距分別在0.3、0.4、0.6、0.9，顯著性明顯;不同開(kāi)花期的AACT的表達(dá)量相差較大，初花期的月月桂花瓣AACT表達(dá)量最高，AACT表達(dá)量為0.9左右，而凋謝期中AACT表達(dá)量最低為0.4左右。
　　4.利用BamH1-Kpn1雙酶切和T4連接酶，將1218bp的AACT基因插入11633bp的pCMBIA2301質(zhì)粒中，得到CaMV35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的OsAACT表達(dá)的植物