基于克隆技術(shù)構(gòu)建基因修飾兔模型的研究.pdf

1、隨著越來越多的基因組序列相繼被識別，人類對生物本質(zhì)的認識已經(jīng)發(fā)生了重大的變化，如何利用這些基因信息來研究其功能呢？在基礎(chǔ)研究中，比較常用的方法是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因打靶技術(shù)構(gòu)建動物模型來進行相關(guān)的研究。在生產(chǎn)基因修飾的大動物的過程中，基于克隆技術(shù)的轉(zhuǎn)基因動物和基因打靶動物模型的制作在醫(yī)學(xué)及基礎(chǔ)科學(xué)等領(lǐng)域的研究中處于舉足輕重的地位。
　　目前家兔已經(jīng)被廣泛用作模擬研究人類相關(guān)疾病的實驗動物模型，包括心血管疾病、代謝疾病、呼吸系統(tǒng)疾病

2、和各種類型的癌癥疾病。兔具有一些優(yōu)于其他實驗動物的特性:其體型能夠允許一些不能在小鼠和大鼠身上實施的手術(shù)得以實現(xiàn)，而且它們系統(tǒng)發(fā)生上更接近人類。此外，在人類生殖領(lǐng)域研究中，一些基因的高度保守性顯示兔將是研究人類胚胎植入前發(fā)育的一個有價值的動物模型，而且其胚胎和胎兒-胎盤發(fā)育與人類相似。然而，目前僅有數(shù)量有限的轉(zhuǎn)基因兔和自然突變兔模型可供研究，因此通過基因改造獲得實驗動物模型兔具有非常廣闊的應(yīng)用前景和理論價值。
　　本研究以家兔克隆

3、技術(shù)為基礎(chǔ)構(gòu)建基因修飾兔模型，分兩部分內(nèi)容:
　?。ㄒ唬┪覀儤?gòu)建了兔Oct4啟動子驅(qū)動EGFP表達的一個報告質(zhì)粒(prOG)，并通過體細胞轉(zhuǎn)染和核移植技術(shù)(SCNT)獲得了prOG轉(zhuǎn)基因克隆兔。prOG轉(zhuǎn)基因胚胎和prOG轉(zhuǎn)基因兔F1代胚胎均能觀察到綠色熒光的表達，而且在27 dpc兔胎兒生殖器官也有綠色熒光的表達。之后，我們分別建立培養(yǎng)了prOG-SSCs和prOG-ES細胞系，觀察到綠色熒光的表達;并且發(fā)現(xiàn)了兔ES細胞的異質(zhì)性

4、，分離兩種細胞后進行了初步的表觀遺傳分析。prOG轉(zhuǎn)基因兔作為研究兔多能性細胞來源和維持的一個新模型，為兔多能性細胞的相關(guān)研究提供了便利，同時也可能會進一步促進兔胚胎發(fā)生過程中的機理研究。
　　（二）在這部分研究中，我們闡述了通過重組型腺相關(guān)病毒(rAAV)介導(dǎo)的HPRT基因同源重組打靶克隆兔的制作過程。為了提高基因的靶向效率，我們采用了基因捕獲的設(shè)計策略。通過不同的設(shè)計策略，分別建立了雄性和雌性不同類型的基因打靶成纖維細胞系;將