Atgl基因敲除對C57BL-6小鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能的影響及機制研究.pdf

1、糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)已成為導致終末期腎病的首要原因，糖尿病腎病的防治已成為亟待解決的全球性健康問題。盡管如此，臨床上對糖尿病腎病實際干預治療的手段和療效非常有限，從某種程度上講，是由于其發(fā)病的病理學機制仍不清楚。而越來越多的臨床和基礎研究提示脂質(zhì)代謝與其關系密切。
　　越來越多的研究提示脂代謝紊亂可能通過多種途徑參與了糖尿病腎病的發(fā)病過程。血漿中過量的甘油三酯和其代謝產(chǎn)物游離脂肪酸可

2、通過炎癥或直接粘附的方式影響血管內(nèi)皮細胞功能;過量的細胞外游離脂肪酸又可以轉(zhuǎn)運進脂肪細胞或非脂肪細胞并以甘油三酯的形式儲存在胞漿脂滴中。脂肪細胞具有獨特的儲存甘油三酯的能力。然而，對于非脂肪細胞如足細胞來講，儲存甘油三酯的能力十分有限。盡管甘油三酯被認為是最中性無害的細胞內(nèi)脂質(zhì)存貯形式，甘油三酯的堆積一方面可以對細胞形成物理壓迫;另一方面，其中間代謝產(chǎn)物如甘油二酯、神經(jīng)酰胺等可以對細胞產(chǎn)生損傷，這種效應被稱為脂毒性作用。在腎臟中，可以導

3、致腎小管間質(zhì)性炎癥、纖維化甚至是腎衰。
　　脂肪甘油三酯脂肪酶是脂質(zhì)分解過程中的重要組分，它是甘油三酯分解代謝中第一步反應的限速酶。Haemmerle, et al.等首次在Atgl基因敲除(Atgl-/-)小鼠包括心肌、肝臟和腎臟等內(nèi)臟器官中發(fā)現(xiàn)存在大量甘油三酯聚集。自此之后，越來越多的研究證實Atgl在維持心臟和肝臟正常結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮了重要作用。然而關于Atgl與腎臟之間的關系還并不清楚。我們在預實驗中發(fā)現(xiàn)Atgl-/-小、

4、鼠尿白蛋白增加，這提示其腎小球濾過屏障可能受損。
　　目的：
　　通過觀察Atgl-/-小鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能的變化明確Atgl基因缺失對腎臟的影響，并通過構(gòu)建ATGL低表達足細胞模型，研究Atgl影響腎臟功能的可能機制。
　　方法：
　　1.檢測Atgl-/-小鼠血清TG，F(xiàn)FA，TC濃度以及心臟、肝臟、腎臟組織中甘油三酯的含量。
　　2.檢測Atgl-/-小鼠尿白蛋白肌酐比(ACR)和血漿肌酐(sCr)濃度

5、以了解Atgl敲除對腎功能的影響;通過功能磁共振(fMRI)觀察Atgl敲除前后腎小球濾過屏障的變化。HE染色觀察腎臟結(jié)構(gòu)改變，油紅O染色觀察脂滴在腎臟中的分布情況。透射電鏡觀察腎臟的超微結(jié)構(gòu)改變。
　　3.利用Atgl-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染條件永生化足細胞的方法構(gòu)建ATGL低表達的足細胞模型。F-actin染色觀察細胞內(nèi)微絲排列變化，annexin V-Cy3染色和TUNEL染色觀察細胞死亡數(shù)量及主要死亡方式。
　　4.利

6、用活性氧(ROS)清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)處理足細胞，觀察ROS清除前后細胞微絲分布及細胞凋亡數(shù)量改變。
　　結(jié)果：
　　1.從第8周開始，Atgl-/-小鼠體重較Atgl+/+小鼠明顯增加，并隨著時間的增長，增加的幅度越來越大。Atgl-/-小鼠血清FFA、TG、TC濃度均較Atgl+/+小鼠明顯降低;心臟、肝臟、腎臟中TG含量較Atgl+/+小鼠相比均有顯著升高，提示Atgl-/-小鼠存在明顯的脂質(zhì)異位沉積

7、。
　　2.Atgl-/-小鼠尿ACR明顯升高，HE染色提示腎小球腎小管中均有明顯脂滴堆積，腎小囊腔明顯縮小;fMRI進一步提示腎小球濾過屏障受損。油紅O染色顯示脂滴彌漫性分布于腎小球和腎小管中，其中以腎小管為主。電鏡下觀察到足細胞和腎小管細胞中有大量脂滴存在;腎小球足細胞足突融合消失;腎小管微絨毛萎縮脫落，足細胞及腎小管細胞內(nèi)線粒體腫脹，內(nèi)脊消失。
　　3.ATGL低表達的足細胞內(nèi)ROS含量顯著升高，F(xiàn)-actin染色提示

8、纖維肌動蛋白增粗并由細胞中央向細胞周邊分布，annexin V-Cy3染色和TUNEL染色提示細胞凋亡明顯增加，這種效應可以被活性氧清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸部分緩解。
　　結(jié)論：
　　綜上所述，我們的結(jié)果說明Atgl基因在維持正常的脂代謝、腎臟結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用。Atgl基因敲除導致小鼠腎臟中甘油三酯大量沉積并導致腎小球濾過屏障受損，尿白蛋白增加，這可能主要是通過改變足細胞微絲排列和線粒體結(jié)構(gòu)，導致足細胞足突融合和