基因單核苷酸多態(tài)性與肺炎支原體肺炎易感性及嚴(yán)重性相關(guān)性研究.pdf

1、研究目的：
　　本研究中一方面從遺傳學(xué)角度研究基因多態(tài)性與支原體肺炎的相關(guān)性，為支原體感染的預(yù)防控制、早期診斷和治療提供多方位的論證;另一方面對山東地區(qū)支原體肺炎患兒肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)進行肺炎支原體P1基因分型及基因測序，探討山東地區(qū)肺炎支原體流行亞型及其基因變異情況;同時收集不同型別肺炎支原體感染患兒的臨床資料，探討肺炎支原體亞型與疾病嚴(yán)重程度之間是否存在相關(guān)性。目前

2、對兒童支原體肺炎在病原學(xué)及解剖結(jié)構(gòu)方面報道較多，而BALF中細胞因子變化的研究尚不多。通過對支原體肺炎患兒BALF中IL-6、IL-27水平的檢測，探究各種疾病狀態(tài)下IL-6與IL-27的水平變化情況，比較各組細胞因子水平有無差異性，評估IL-6與IL-27的水平與重癥支原體肺炎的發(fā)生是否具有相關(guān)性，能否反應(yīng)該疾病的嚴(yán)重程度，盡可能的發(fā)掘更多的重癥支原體肺炎識別方法，爭取能為重癥支原體肺炎早期發(fā)現(xiàn)、診斷及治療提供更多的論據(jù)。
　　

3、研究方法：
　　本研究主要分為三個部分，第一部分中，采用病例-對照研究方法，收集2014年10月至2016年6月間于山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院住院的415例支原體肺炎患者外周靜脈血標(biāo)本，其中重癥肺炎205例，非重癥肺炎210例，同時收集兒保門診健康查體300例健康兒童的外周血標(biāo)本，以415例支原體肺炎患者和300例健康兒童為研究對象，提取各研究對象的基因組DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)及測序方法對ACErs4340、GSTM1(Ins/del

4、)、IL-6(rs1800795)、NOS3(rs1799983)及CYP1A1(rs2606345)進行基因分型，用SPSS統(tǒng)計軟件分析各多態(tài)性位點與MPP嚴(yán)重程度的相關(guān)性，從宿主層面來分析某些特定人群對支原體感染有無易感性，及與肺炎嚴(yán)重程度有無相關(guān)性。
　　第二部分于山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院住院部收集2015-2016年肺炎患兒的肺泡灌洗液，對診斷為MPP的240例患兒肺泡灌洗液標(biāo)本進行P1基因分型，并進行基因測序，探討此期間山東

5、地區(qū)肺炎支原體流行亞型及其基因變異情況;同時收集該組患兒的臨床資料，分析肺炎支原體亞型與疾病嚴(yán)重程度之間的相互關(guān)系。數(shù)據(jù)用SPSS22.0軟件進行分析，采用卡方檢驗和方差分析的方法來分析臨床癥狀和人口統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)（年齡和性別）。
　　第三部分為了探討兒童肺炎支原體與肺泡灌洗液中細胞因子之間的相互關(guān)系，選擇臨床采集的無肺部病變的支氣管異物患兒與MPP患兒的肺泡灌洗液作為對照組與研究組，采用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)技術(shù)監(jiān)測MPP患兒B

6、ALF中IL-6、IL-27水平，收集各組支原體肺炎患兒是否混合感染，病情輕重及肺泡灌洗液中MP-DNA拷貝值等臨床及實驗數(shù)據(jù)。ELISA檢測結(jié)果采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，連續(xù)性正態(tài)分布的計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組均數(shù)的兩兩比較采用LSD檢驗方法。
　　研究結(jié)果：
　　第一部分中，研究發(fā)現(xiàn)，ACErs4340、NOS3rs1799983、CYP1A1rs260634

7、5存在三種基因型，但IL-6rs1800795和GSTM1基因(Ins/del)只有野生型和雜合型。對照組各單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisin，SNP)基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。病例和對照組中，ACErs4340ID(42.67％vs54.22％，OR=1.81，95％CI:1.31-2.48,P＜0.001),IL-6rs1800795GC(1.33％

8、vs5.78％,OR=4.54,95％CI:1.56-13.23,P=0.003),NOS3rs1799983TT(3.20％vs8.82％，OR=6.53，95％CI:1.95-21.87，P＜0.001)和等位基因的分布ACErs4340I(OR=1.32,95％CI:1.06-1.65，P=0.014)/NOS3rs1799983T(OR=1.48,95％CI:1.07-2.05,P=0.018)/IL-6rs1800795C(O

9、R=4.44,95％CI:1.53-12.86，P=0.0027)比較有統(tǒng)計意義，表明ACErs4340ID、IL-6rs1800795GC和NOS3rs1799983TT與MPP的風(fēng)險增加有關(guān)。而對于GSTM1(Ins/del)和CYP1A1rs2606345G/T，病例組和對照組比較基因型分布無明顯差異，Logistic回歸也未發(fā)現(xiàn)這兩個多態(tài)位點與MPP易感性相關(guān)。
　　繼續(xù)分析ACErs4340、GSTM1基因(Ins/de

10、l)、IL-6rs1800795、NOS3rs1799983和CYP1A1rs2606345各基因-基因之間的相互作用。等位基因頻率組合表示，ACErs4340D/NOS3rs1799983T/CYP1A1rs2606345G(OR=3.08,95％CI:1.80-5.26);ACErs4340D/NOS3rs1799983T(OR=3.44,95％CI:2.01-5.89)基因攜帶者，MPP患病風(fēng)險明顯高于對照組。應(yīng)用MDR分析軟件繼

11、續(xù)探討這一群體中研究基因的SNP-SNP的交互作用。最終，ACErs4340及NOS3rs1799983被認(rèn)定為與MPP發(fā)病風(fēng)險最大(CV consisitency=9/10)。同時使用SAS軟件(version9.1.3portable)分析各SNP組合后的發(fā)病風(fēng)險，結(jié)果表明ACErs4340和NOS3rs11799983遺傳多態(tài)性的組合頻率在MPP病人(n=415)病例和對照組之間存在顯著差異(OR=3.32,95％CI:1.90-

12、5.85)。
　　此外，在415例MPP患者中，我們分析了各多態(tài)位點與MPP病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)，ACErs4340I等位基因攜帶者，嚴(yán)重MMP發(fā)生的風(fēng)險要高1.44倍(OR=1.44,95％CI:1.05-1.97，P=0.024),IL-6rs1800795C等位基因攜帶者，發(fā)生嚴(yán)重MMP的風(fēng)險要高6.9倍(OR=6.9，95％CI:2.14-22.22，P=0.001)。綜上所述，本研究提示SNP在MPP高風(fēng)險個體篩查中

13、的潛在應(yīng)用價值。
　　第二部分通過巢式多重PCR方法對240例MPP患兒肺炎支原體P1分型檢出P1-Ⅰ型228例，P1-Ⅱ型12例。研究表明，在研究期間，山東地區(qū)發(fā)生的MP感染以P1-Ⅰ型為主，未發(fā)現(xiàn)變異株。這一結(jié)果與歐洲某些國家，以及中國北京、浙江、天津等地區(qū)學(xué)者監(jiān)測結(jié)果相同。進一步分析發(fā)現(xiàn)P1-Ⅱ型中重癥比例高于P1-Ⅰ型，肺炎支原體P1亞型與肺部感染嚴(yán)重程度可能存在相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.018＜0.05）。

14、>　　第三部分本研究BALF中的IL-6水平可反映MPP患者肺部感染程度，IL-6水平越高，肺部感染程度越重，高水平的IL-6與重癥MPP的發(fā)生具有相關(guān)性，未發(fā)現(xiàn)IL-27水平與重癥MPP的發(fā)生具有相關(guān)性;進一步分組分析，單純支原體感染與混合支原體感染，都存在IL-6水平升高，混合感染相對于單純感染，有統(tǒng)計學(xué)意義，而IL-27在混合感染組降低明顯，與單純組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與對照組比較有顯著差異;肺泡灌洗液的MP-DNA拷貝值，其高

15、低與IL-6分泌水平存在相關(guān)性，而與IL-27無相關(guān)性。
　　研究結(jié)論：
　　1.ACErs4340，IL-6rs1800795和NOS3rs1799983的多態(tài)性與MPP易感性存在統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián);
　　2.交互分析證明，兒童ACErs4340D/NOS3rs1799983T基因攜帶者，MPP患病風(fēng)險明顯增高;
　　3.ACErs4340I及IL-6rs1800795C等位基因攜帶者，發(fā)生重癥MMP的風(fēng)險要高;