豆野螟嗅覺相關(guān)基因GOBP1、CSP1和OBP1的功能分析.pdf

1、在漫長的進(jìn)化歷程中，昆蟲逐漸具備了極其靈敏的嗅覺系統(tǒng)，并以此感知來自于外界的多種化學(xué)刺激并作出相應(yīng)的生理行為反應(yīng)，如尋找配偶、定位食物源和棲息地，兩性交流，聚集產(chǎn)卵和趨避敵害等，由此可見，嗅覺及化學(xué)感受系統(tǒng)在昆蟲的各項(xiàng)生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要功能。通過鑒定篩選靶標(biāo)害蟲信息素成分干擾和阻斷昆蟲的嗅覺識別行為，并將其成功應(yīng)用于田間實(shí)踐一直是害蟲綜合生物防控的重要措施之一。豆野螟是一種在世界范圍內(nèi)都具有較大危害的豆科作物害蟲，其幼蟲具有較強(qiáng)的鉆蛀

2、習(xí)性，化學(xué)藥劑的大量使用不易殺死害蟲，并容易導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)，嚴(yán)重威脅各蔬菜基地豆類蔬菜產(chǎn)品的供應(yīng)和食品安全。豆野螟主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，幼蟲主要蛀食豆科作物幼嫩的花、葉和豆莢等，給豆科蔬菜生產(chǎn)造成了巨大的損失。
　　基于課題組前期豆野螟觸角轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，我們克隆、表達(dá)并純化了豆野螟MvitGOBP1、MvitCSP1、MvitOBP1，采用RT-PCR技術(shù)分析檢測這三個(gè)基因在豆野螟成蟲的不同組織的表達(dá)情況。利用熒光競爭結(jié)

3、合實(shí)驗(yàn)分析研究了MvitGOBP1、MvitCSP1、MvitOBP1與寄主植物花揮發(fā)性化合物的結(jié)合，并利用三維結(jié)構(gòu)模擬以及分子對接技術(shù)對MvitGOBP1、MvitC SP1蛋白與配體分子的可能的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。主要研究結(jié)果如下:
　　1.豆野螟MvitGO BP1、MvitCSP1、MvitOBP1的克隆、序列和進(jìn)化分析
　　克隆獲得豆野螟三個(gè)嗅覺基因，分別命名為MvitGOBP1、MvitCSP1、MvitOBP

4、1，序列分析三個(gè)基因的ORF分別為486bp、387bp和471bp。多重序列比對顯示，MvitGOBP1、MvitCSP1和MvitOBP1均與鱗翅目其他昆蟲的相應(yīng)基因具有較高的相似性。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，MvitGOBP1與CmedGOBP1聚為一支，MvitCSP1和CmedCSP，MvitOBP1和CmedOBP11分別具有較高序列相似性。
　　2.組織特異性表達(dá)分析
　　利用熒光定量PCR技術(shù)分析檢測了MvitGOB

5、P1、MvitCSP1和MvitOBP1在豆野螟成蟲不同組織的表達(dá)水平。結(jié)果表明，這三個(gè)基因主要在觸角中高表達(dá)，在頭、足和翅等組織中分別有少量的表達(dá)分布。
　　3.MvitGOBP1、MvitCSP1和MvitOBP1的原核表達(dá)及親和層析純化
　　將構(gòu)建好的原核表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，不同IPTG條件誘導(dǎo)后破碎取上清，采用Ni柱親和層析的方法來純化目的蛋白，并利用腸激酶切除His標(biāo)簽。SDS-PAGE

6、分析檢測顯示，這三個(gè)蛋白大小在25 kD到35kD之間產(chǎn)生特異性的條帶。
　　4.熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)
　　熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MvitGOBP1對1H-Indol-4-ol（4-羥基吲哚）、Butanoic acid butyl ester(丁酸丁酯)和Limonene(檸檬烯)的結(jié)合能力較強(qiáng);MvitCSP1對1H-Indol-4-ol和2-methyl-3-phenylpropanal(2-甲基-3-苯基丙醛)的結(jié)合

7、能力較強(qiáng);MvitOBP1對1H-Indo1-4-ol和Butanoic acid butyl ester的結(jié)合能力較強(qiáng)。
　　5.田間誘捕試驗(yàn)
　　基于嗅覺目的蛋白與寄主揮發(fā)物的結(jié)合特性分析結(jié)果，我們從17種豇豆花揮發(fā)物氣味分子中選取了六種結(jié)合能力較強(qiáng)的化合物來進(jìn)行田間誘捕實(shí)驗(yàn)，分別是Butanoic acid butyl ester、Limonene、1H-Indol-4-ol、2-methyl-3-phenylprop

8、anal、Butanoic acid octyl ester（丁酸辛酯）和4-ethylpropiophenone（乙基苯丙酮）。田間誘捕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對于空白對照組，這六種化合物均能夠有效吸引雌蛾，產(chǎn)生類似產(chǎn)卵聚集效應(yīng)，其中檸檬烯的誘捕效果最為顯著。
　　6.同源建模和分子對接
　　通過構(gòu)建目的蛋白三維結(jié)構(gòu)模型與分子對接分析，我們發(fā)現(xiàn)MvitGOBP1和MvitCSP1的結(jié)合腔主要由疏水性氨基酸組成，促進(jìn)兩種嗅覺蛋白與寄

9、主揮發(fā)物成分1H-indol-4-ol和2-methyl-3-phenylpropanal的特異性結(jié)合，推測可能的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分別是Asn83和Arg127，Thr26和Glu63。
　　上述試驗(yàn)結(jié)果表明，MvitGOBP1、MvitCSP1和MvitOBP1在豆野螟不同組織中分布廣泛，結(jié)合特性分析和田間誘捕試驗(yàn)表明，MvitGOBP1、MvitCSP1和MvitOBP1在豆野螟的寄主識別以及產(chǎn)卵定位等嗅覺生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作