稻瘟病菌MNH1和MgYCA1基因的克隆與功能分析.pdf

1、稻瘟病是水稻上重要的病害之一，其病原菌為子囊菌Magnaporthe grisea。了解M. grisea的致病機理不僅有利于稻瘟病的防治，而且作為研究植物病原真菌與寄主互作的理想模式系統(tǒng)，M. grisea的侵染過程，包括產(chǎn)孢，萌發(fā)和附著胞的分化和成熟都具有典型性，對于了解其它真菌的致病機理也有重要意義。致病相關(guān)基因的克隆和分析是達(dá)到這一目標(biāo)的有效途徑。本文克隆了稻瘟病菌的二個基因MNH1和MgYCA1，并通過與GFP蛋白的融合表達(dá)研

2、究了MNH1和MgYCA1基因在細(xì)胞中的作用位點，通過基因敲除的方法分析了MNH1和MgYCA1基因在稻瘟病菌致病性及其他相關(guān)過程的作用。具體研究結(jié)果如下： 1. 利用PCR的方法從稻瘟病菌附著胞cDNA文庫中克隆到一個功能未知基因MNH1；利用酵母的MCAl基因的蛋白序列，在稻瘟病菌中找到同源基因，并從cDNA文庫克隆到了這一基因，定名為MgYCA1。獲得全長cDNA經(jīng)測序后，進(jìn)行功能分析。 2. 通過構(gòu)建MNH1和M

3、gYCA1基因置換載體和敲除轉(zhuǎn)化，得到潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR和Southem雜交鑒定獲得的Knock-out突變子，MNH1和MgYCA1在Guy11菌株中均為單拷貝。 3.△MNH1和△MgYCAl突變子在CM培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)與野生型相同，生長速度無明顯改變。在N饑餓，C饑餓，高滲(1M NaCl)脅迫條件下的菌落形態(tài)，生長速度與野生型比較也無明顯差異。 4.構(gòu)建pNAR-MNH1-eGFP、pN-AR-eGFP

4、-MNH1和pNAR-eGFP-MCAl熒光蛋白表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至稻瘟病菌原生質(zhì)體，定位這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的作用位置，它們在細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。 5.AMNH1突變子在確認(rèn)非發(fā)酵性碳源的YPEG培養(yǎng)基上菌落形態(tài)與野生型不同，而且生長速度比野生型快，野生型菌落顏色較白，突變子的顏色正常。 6.△MNH1和△MgYCAl突變子在大麥葉片上和水稻上的致病力與野生型相比都沒有變化。 7.△MNH1和△MgYCAl突變子在OM