豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外向心肌樣細(xì)胞分化過(guò)程中Notch4下調(diào).pdf

1、目的：檢測(cè)豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)體外培養(yǎng)自發(fā)分化和誘導(dǎo)分化過(guò)程中Notch4mRNA、Notch4蛋白的變化趨勢(shì)，探討Notch4受體對(duì)MSCs體外向心肌細(xì)胞分化的影響。
　　 方法：密度梯度離心法分離中華小型豬骨髓單個(gè)核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)法篩選出MSCs體外培養(yǎng)，原代(PO)培養(yǎng)后按1:2比例每3天傳代一次。選取第1，2，3和4代(P1，P2，P3和P4)MSCs，連續(xù)鏡下觀察

2、MSCs的形態(tài)變化，同時(shí)檢測(cè)自發(fā)分化和5.氮胞苷誘導(dǎo)分化狀態(tài)下它們Notch4mRNA水平和Notch4蛋白表達(dá)量的差異。RealTimeRT-PCR定量檢測(cè)細(xì)胞Notch4mRNA表達(dá)量，以及心肌結(jié)構(gòu)基因和特異性基因的表達(dá)量，包括Cx43和cTnl；Western-blot法檢測(cè)不同細(xì)胞Notch4蛋白的表達(dá)水平；免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)MSCs的表面標(biāo)志(CD34、CD45、CD90和CD29)及心肌細(xì)胞特異性的蛋白表達(dá)，包括a-橫紋

3、肌肌動(dòng)蛋白(a-sarcomericactin，a-actin)、心肌肌鈣蛋白-T(cardiactroponin-T，cTn-T)和連接蛋白43(connexin43，Cx43)；以透射電鏡觀察分化細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：5天可見(jiàn)貼壁圓形的MSCs逐漸出現(xiàn)多角狀突觸，呈長(zhǎng)梭形，經(jīng)過(guò)7-10天培養(yǎng)，原代(passage0，P0)MSCs形成均一的細(xì)胞克隆，融合70-80％；1:2傳代以后第二天細(xì)胞即可貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞為多角長(zhǎng)梭

4、形，數(shù)量增殖到較多時(shí)呈漩渦狀生長(zhǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)表型鑒定CD45(-)，CD29(+)，CD90(+)。豬骨髓來(lái)源的MSCs在體外正常培養(yǎng)狀態(tài)下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)(PO-P4)，細(xì)胞之間的連接增多(Cx43表達(dá)量上升)，心肌特異性標(biāo)志物增多(cTnI表達(dá)量上升)，與此同時(shí)Notch4較原代細(xì)胞顯著下調(diào)；5-氮胞苷(10μM)誘導(dǎo)2周后，Notch4的基因表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，Notch4陽(yáng)性細(xì)胞與對(duì)照組相比顯著減少，各代MSCs可