AXL在非小細(xì)胞肺癌中的作用及與EGFR信號(hào)通路相關(guān)性研究.pdf

1、在我國(guó)以及世界范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率及死亡率均位于常見(jiàn)惡性腫瘤的前列。非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）為肺癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類(lèi)型，主要包括鱗癌和腺癌。近年來(lái)，表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosine Kinase Inhibitor, TKI）在特定位點(diǎn)突變NSCLC治療中的療效值得肯定，但隨之出現(xiàn)的耐藥

2、問(wèn)題已經(jīng)成為NSCLC分子靶向治療的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。針對(duì)EGFR-TKI治療的耐藥機(jī)制包括原發(fā)耐藥和繼發(fā)耐藥兩種，揭示相關(guān)耐藥機(jī)制對(duì)于肺癌患者的有效治療是十分必要和迫切的問(wèn)題。
　　AXL屬于受體酪氨酸激酶（RTKs）家族，又稱(chēng)TAM家族，主要包括AXL、Tyro3(Sky)和 Mer。從第一次在慢性粒細(xì)胞白血病患者中分離獲得后，AXL已被發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)多種細(xì)胞中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)。近來(lái)，在多種類(lèi)型的腫瘤研究中，AXL被視為調(diào)節(jié)常規(guī)治療和腫瘤靶向治

3、療耐藥的研究焦點(diǎn)。在NSCLC的治療中，有研究通過(guò)對(duì)EGFR-TKI產(chǎn)生繼發(fā)耐藥患者腫瘤組織的二次活檢，發(fā)現(xiàn)AXL高表達(dá)為第二大耐藥分子標(biāo)記。此外， AXL基礎(chǔ)表達(dá)也與EGFR野生型NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI的原發(fā)耐藥有關(guān)。因此，深入了解AXL在NSCLC對(duì)EGFR-TKI繼發(fā)及原發(fā)耐藥中的作用機(jī)制具有重要臨床意義。然而，NSCLC組織中AXL和EGFR兩個(gè)受體激酶之間表達(dá)的相關(guān)性、以及AXL表達(dá)與EGFR突變狀態(tài)的關(guān)系、抑制AX

4、L表達(dá)能否提高NSCLC細(xì)胞（EGFR野生型）對(duì)藥物的敏感性等問(wèn)題，目前尚不清楚。
　　鑒于此，本研究第一部分利用肺腺癌患者手術(shù)切除石蠟組織作為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)組織中EGFR突變（19外顯子缺失及21外顯子L858R）、AXL、EGFR、pEGFR1068蛋白表達(dá)，分析AXL與EGFR通路在原發(fā)肺腺癌組織中的相關(guān)性；第二部分以NSCLC細(xì)胞株—A549及H1299為研究對(duì)象，從細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡、細(xì)胞遷移能力等方面，檢測(cè)A

5、XL在細(xì)胞中的生物學(xué)作用，同時(shí)觀(guān)察AXL對(duì)EGFR下游信號(hào)通路AKT及ERK的影響。第三部分進(jìn)一步探討AXL在A549及H1299細(xì)胞對(duì)化療及靶向治療藥物反應(yīng)中的作用。
　　第一部分：膜受體激酶AXL與EGFR通路在原發(fā)肺腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)分析
　　目的:檢測(cè)EGFR基因19外顯子缺失、21外顯子L858R點(diǎn)突變及20外顯子T790M在肺腺癌組織中的突變情況；檢測(cè)AXL、EGFR、pEGFR1068蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)

6、及與臨床病理特征的相關(guān)性；進(jìn)一步分析AXL與EGFR、pEGFR1068在EGFR突變及野生型病例中的共表達(dá)情況。
　　方法：
　　1.病例信息
　　共收集術(shù)前未經(jīng)放療或化療的原發(fā)肺腺癌患者手術(shù)切除標(biāo)本109例，標(biāo)本經(jīng)10％中性福爾馬林固定液固定，石蠟包埋切片備用。
　　2.基因組DNA提取
　　應(yīng)用TIANamp FFPE DNA試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明提取109例石蠟切片組織中的基因組DNA。
　　

7、3.PCR結(jié)合測(cè)序方法檢測(cè)EGFR19和21外顯子突變
　　采用巢式PCR方法擴(kuò)增EGFR19、21外顯子，產(chǎn)物經(jīng)ABI3730XL DNA分析儀進(jìn)行 Sanger序列分析。本部分由Invitrogen公司提供服務(wù)（合同號(hào)MB140120001B）。
　　4.ARMS PCR（amplification refractory mutation specific PCR）
　　采用人類(lèi) EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒（ADx

8、-EG10, Amoy Diagnostics Co., LTD, China）對(duì)109例肺癌組織EGFR突變進(jìn)行檢測(cè)。共檢測(cè) EGFR基因4種突變，包括：Ex19-mutant-1:E746_A750del(2235-2249 del15)、Ex19-mutant-2: E746_A750del(2236-2250 del15)、Ex21-mutant-1: L858R(2573T>G)以及Ex20-mutant-1:T790M(23

9、69C>T)。
　　5.免疫組織化學(xué)方法
　　采用免疫組織化學(xué)染色方法，檢測(cè)109例肺腺癌患者腫瘤組織石蠟包埋切片中AXL、EGFR和pEGFR1068的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。
　　6.統(tǒng)計(jì)分析
　　應(yīng)用卡方檢驗(yàn)檢驗(yàn)肺腺癌組織中AXL、EGFR和 pEGFR1068表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性。應(yīng)用Spearman相關(guān)分析方法評(píng)估突變組與野生組之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.1

10、09例人肺腺癌病例中EGFR突變檢測(cè)
　　1.1.PCR結(jié)合直接測(cè)序法
　　109例病例中，19外顯子缺失病例為25例（22.9%），E746-A750del是最常見(jiàn)的類(lèi)型（13/25，52.0%）。21外顯子L858R點(diǎn)突變陽(yáng)性者為22例（20.2%）。綜上，PCR直接測(cè)序法共檢測(cè)到19Del或21 L858R陽(yáng)性者47例，陰性62例，總體突變率為43.1%（47/109）。
　　1.2.ARMS方法
　　為了

11、避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果，進(jìn)一步利用ARMS方法對(duì)PCR-直接測(cè)序檢測(cè)為陰性的62例進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，有21例（33.9%）為EGFR突變陽(yáng)性。綜合PCR直接測(cè)序結(jié)果和ARMS檢測(cè)結(jié)果，109例肺腺癌患者中攜帶EGFR19del、21 L858R常見(jiàn)突變的發(fā)生率為62.4%（68/109）。此外，在109例病例中只有2例（1.83%）出現(xiàn)T790M突變。
　　2.AXL、EGFR和pEGFR1068在人肺腺癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的

12、相關(guān)分析：
　　2.1.AXL蛋白表達(dá)
　　免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明，109例肺腺癌組織中，AXL蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為55.0%（60/109）,其表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P=0.035），但AXL表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、腺癌亞型等均無(wú)相關(guān)性。
　　2.2.EGFR蛋白表達(dá)
　　109例肺腺癌組織中EGFR蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為62.4%（68/109），結(jié)合患者臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，EGFR表達(dá)與腺癌

13、亞型（P=0.02）、腫瘤大?。≒<0.001）、以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.007）相關(guān)，而與患者年齡、性別、TNM分期等無(wú)顯著相關(guān)性。
　　2.3.pEGFR1068表達(dá)
　　109例肺腺癌組織中pEGFR1068蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為52.3%（57/109）。在腫瘤直徑＞3cm的病例中， pEGFR1068表達(dá)量明顯高于直徑≤3cm者（P<0.001）；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組病例中，pEGFR1068表達(dá)量明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P<

14、0.001）。
　　3.AXL、EGFR/pEGFR1068表達(dá)與EGFR19 del和（或）L858R突變狀態(tài)的相關(guān)性：
　　109例患者中，單獨(dú)出現(xiàn)EGFR19 del突變者共32例，19 del陰性者77例；單獨(dú)出現(xiàn)L858R突變者共34例，L858R突變陰性者75例；表現(xiàn)為19 del或L858R突變者共68例，陰性者41例。
　　3.1.AXL表達(dá)與突變的相關(guān)性：
　　統(tǒng)計(jì)分析表明， AXL表達(dá)與單獨(dú)攜

15、帶19 del突變無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P=0.05），AXL表達(dá)與單獨(dú)L858R突變、19 del/L858R突變狀態(tài)無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。
　　3.2.EGFR蛋白表達(dá)與突變的相關(guān)性：
　　在單獨(dú)攜帶L858R突變的病例中EGFR蛋白表達(dá)率（76.5%,26/34）顯著高于L858R陰性組（56.0%，42/75；P=0.04）。EGFR蛋白表達(dá)與單獨(dú)19 del、19 del/L858R突變狀態(tài)無(wú)相關(guān)性。
　　3.3.

16、pEGFR1068表達(dá)與突變的相關(guān)性：
　　在34例單獨(dú)攜帶L858R突變的病例中，pEGFR1068的陽(yáng)性表達(dá)率為73.5%（25/34）,顯著高于L858R陰性病例（42.7%, P=0.003）。在68例19 Del/L858R突變者中， pEGFR1068的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于突變陰性組（60.3%v.s.14.6%, P=0.031）。
　　4.AXL與EGFR/pEGFR1068共表達(dá)情況檢測(cè)
　　去除2例T

17、790M突變病例，在剩余的107例肺腺癌患者中，37例顯示AXL和EGFR共表達(dá)，30例患者顯示AXL和pEGFR1068共表達(dá)，25例患者顯示 AXL, EGFR和 pEGFR1068共表達(dá)。進(jìn)一步分析表明AXL+/EGFR+/pEGFR1068共表達(dá)百分率在EGFR突變患者顯著高于EGFR野生型患者（30.9%vs.10.3%, P=0.015）。
　　小結(jié)：
　　1、109例肺腺癌病例中EGFR19外顯子缺失突變、21

18、外顯子L858R突變的發(fā)生率較高，達(dá)到62.4%，而20外顯子T790M原發(fā)突變僅為1.83%。
　　2、 AXL蛋白表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組病例中顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；EGFR蛋白表達(dá)與腺癌亞型、腫瘤大小及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)；pEGFR1068蛋白表達(dá)與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。
　　3、 AXL表達(dá)與EGFR突變狀態(tài)間無(wú)顯著相關(guān)性；EGFR、pEGFR1068表達(dá)與EGFR21外顯子 L858R點(diǎn)突變顯著相關(guān)，而且pEGFR1

19、068在攜帶19 Del或L858R突變患者表達(dá)顯著增加，提示EGFR Tyr-1068位點(diǎn)磷酸化與EGFR敏感突變有關(guān)。
　　4、 AXL+/EGFR+/pEGFR1068共表達(dá)率在EGFR突變組顯著高于野生型肺腺癌患者。結(jié)果提示，對(duì)于AXL與EGFR信號(hào)通路共同激活的病例，聯(lián)合應(yīng)用AXL抑制劑與EGFR抑制劑，將有利于改善對(duì)EGFR靶向治療的原發(fā)或繼發(fā)耐藥作用。
　　第二部分：AXL在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中生物學(xué)效應(yīng)的體外實(shí)

20、驗(yàn)研究
　　目的：本研究以非小細(xì)胞肺癌A549、H1299細(xì)胞株為模型，利用siRNA干擾技術(shù)及AXL激酶抑制劑R428抑制AXL表達(dá)及活性，從細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期與凋亡、細(xì)胞遷移能力、以及相關(guān)信號(hào)通路等方面，探討AXL在肺癌中的生物學(xué)效應(yīng)，同時(shí)初步觀(guān)察抑制AXL表達(dá)對(duì)EGFR信號(hào)通路下游分子ERK/p-ERK、AKT/p-AKT表達(dá)的可能作用。
　　方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)及處理
　　人NSCLC細(xì)胞株-A549

21、及H1299，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，常規(guī)傳代。
　　2、 R428處理細(xì)胞
　　按2×104/mL密度接種細(xì)胞于96孔板中，貼壁后更換含1%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24h后，加入不同濃度梯度的R428作用24h，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）值。
　　3、 siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　用100

22、 pmol Negtive control siRNA（NC siRNA）、AXL特異性siRNA轉(zhuǎn)染H1299和A549細(xì)胞，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　4、 MTT檢測(cè)
　　2×104個(gè)/孔細(xì)胞均勻接種于96孔板中，貼壁12小時(shí)后轉(zhuǎn)染細(xì)胞或給予R428處理，MTT比色法計(jì)算細(xì)胞存活率。
　　5、 Real-time PCR
　　提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Real-time PCR方法，檢測(cè)細(xì)胞中AXL mRNA表

23、達(dá)。參照Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct（ΔΔCt）方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。
　　6、蛋白免疫印跡（Western blot）
　　轉(zhuǎn)染至48小時(shí)前兩小時(shí)加入或不加EGF刺激2小時(shí)，提取細(xì)胞總蛋白，采用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)細(xì)胞中AXL、EGFR/pEGFR、ERK/p-ERK、AKT/p-AKT在蛋白水平的表達(dá)情況。
　　7、 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期分布
　　分別收集N

24、C siRNA或AXL siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞、對(duì)照組與R428處理組細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化吹打制備單細(xì)胞懸液，70%乙醇4℃固定過(guò)夜。PI避光染色30min，1h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，應(yīng)用FlowJo7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　8、 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　分別收集NC siRNA或AXL siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞、對(duì)照組與R428處理組細(xì)胞，采用Annexin-V/PI試劑盒，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞在A或D

25、狀態(tài)下的凋亡情況，應(yīng)用FlowJo7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　9、 Transwell小室實(shí)驗(yàn)
　　各組細(xì)胞以2×104個(gè)接種于小室上層，于接種后不同時(shí)間，固定染色后于顯微鏡下觀(guān)察下室細(xì)胞的遷移情況。倒置顯微鏡下任取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞的平均值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　10、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
　　分別于劃痕后0-48h觀(guān)察各組細(xì)胞在劃線(xiàn)兩側(cè)的生長(zhǎng)情況，于顯微鏡下觀(guān)察并拍照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　11、統(tǒng)

26、計(jì)分析
　　應(yīng)用SPSS Statistics19.0軟件，數(shù)據(jù)分析采用兩樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、及直線(xiàn)擬合；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示。P<0.05認(rèn)為差異
　　具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、 AXL siRNA干擾對(duì)A549和H1299細(xì)胞的生物學(xué)作用
　　1.1、 AXL siRNA干擾效率檢測(cè)
　　A549和H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)染AXL siRNA后，Western Blot和q

27、PCR檢測(cè)結(jié)果表明，三個(gè)siRNA序列均可顯著抑制AXL在蛋白和mRNA水平的表達(dá)，我們選擇了其中的一個(gè)siRNA1（AXL siRNA）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　1.2、 AXL siRNA干擾對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　與陰性對(duì)照組相比，AXL siRNA轉(zhuǎn)染抑制AXL表達(dá)可顯著降低A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的存活率（P<0.05）。
　　1.3、 AXL siRNA干擾對(duì)細(xì)胞周期的影響
　　A549細(xì)胞AXL siR

28、NA轉(zhuǎn)染組G0/G1期比例為（86.10±0.10）%，顯著高于陰性對(duì)照組（74.15±0.25）%。而S期、G2M期細(xì)胞比例則顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。但siRNA轉(zhuǎn)染敲低AXL表達(dá)對(duì)H1299細(xì)胞周期無(wú)明顯改變。
　　1.4、 AXL siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
　　與陰性對(duì)照組相比，AXL siRNA轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞總凋亡率有所增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。H1299細(xì)胞AXL siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)

29、照組（P<0.05）。
　　1.5、 AXL siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響
　　Transwell小室檢測(cè)結(jié)果表明，在AXL siRNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞組穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)目明顯低于各自的對(duì)照組（P<0.05）。此外，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，劃痕后48h可見(jiàn)：AXL siRNA轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞劃痕愈合面積（27.43±0.01%）明顯低于對(duì)照組（85.67±0.02%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

30、同樣，在AXL siRNA轉(zhuǎn)染的H1299細(xì)胞組細(xì)胞朝向劃痕的愈合面積明顯低于對(duì)照組細(xì)胞（P<0.05）。綜合上述結(jié)果表明，抑制AXL表達(dá)可降低A549細(xì)胞、H1299細(xì)胞的遷移能力。
　　2、特異性AXL激酶抑制劑—R428對(duì)A549和H1299細(xì)胞的生物學(xué)作用
　　2.1、 R428對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　MTT結(jié)果表明，隨R428處理濃度增加，兩種細(xì)胞存活率逐漸降低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明，A549、H1299細(xì)胞中R42

31、8的IC50值分別為28.98nM、34.71nM。后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們選擇R428的使用濃度為20nM。
　　2.2、 R428對(duì)細(xì)胞周期的影響
　　20nM R428作用24小時(shí)，與對(duì)照組相比， R428處理組A549細(xì)胞G0/G1期比例顯著增加（R428：（88.37±0.15）%；對(duì)照組：（68.60±0.20）%），而S期、G2/M細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05）。此外，R428處理組H1299細(xì)胞周期分布變化與A549變

32、化一致。結(jié)果表明20nM R428處理可引起A549和H1299細(xì)胞G0/G1期阻滯。
　　2.3、 R428對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
　　與對(duì)照組相比，R428處理組A549細(xì)胞總凋亡率無(wú)明顯改變，但是20nM R428處理可引起H1299細(xì)胞凋亡率明顯增高（P<0.05）。
　　2.4、 R428對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響
　　Transwell小室檢測(cè)結(jié)果表明， R428處理可顯著抑制A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞穿過(guò)膜的

33、細(xì)胞數(shù)目（P<0.05）。劃痕48h實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，R428處理組 A549細(xì)胞劃痕愈合面積（15.78±0.01%）明顯低于對(duì)照組（92.45±0.10%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此外，R428處理組H1299細(xì)胞劃痕愈合面積顯著低于對(duì)照組。
　　3、抑制AXL表達(dá)對(duì)細(xì)胞ERK/p-ERK、AKT/p-AKT水平的影響
　　細(xì)胞分為4組：NC siRNA、AXL siRNA、NC siRNA+EGF、AXL si

34、RNA+EGF組。蛋白印跡結(jié)果表明，AXL siRNA轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞、H1299細(xì)胞中p-AKT的水平顯著低于對(duì)照組，但是EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK的水平變化不明顯。給予細(xì)胞EGFR受體的配體—EGF刺激后，細(xì)胞中p-EGFR水平顯著增高，證實(shí)EGFR通路被激活。同時(shí)EGFR下游p-ERK及p-AKT的水平也不同程度升高。但與EGF+NC siRNA處理組相比，AXL siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合EGF刺激后，兩種細(xì)胞中p-A

35、KT的水平顯著被抑制。結(jié)果提示：AXL表達(dá)對(duì)EGFR下游通路p-AKT的活化具有一定的激活作用， AXL與EGFR通路間存在一定的交叉作用。
　　小結(jié)：
　　1、轉(zhuǎn)染AXL siRNA敲低A549、H1299細(xì)胞中AXL在mRNA及蛋白水平表達(dá)，可顯著抑制兩種細(xì)胞的增殖活性，其機(jī)制與細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯或促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　2、20nM AXL激酶抑制劑-R428處理A549、H1299細(xì)胞，可引起兩種細(xì)胞發(fā)生

36、G0/G1期阻滯，顯著抑制細(xì)胞的增殖活性。
　　3、 AXL siRNA轉(zhuǎn)染或R428處理可顯著抑制A549細(xì)胞及H1299細(xì)胞遷移能力。
　　4、轉(zhuǎn)染AXL siRNA敲低AXL表達(dá)，可顯著抑制A549及H1299細(xì)胞中p-AKT的水平。p-AKT作為AXL與EGFR共同的下游信號(hào)分子，AXL對(duì)p-AKT的調(diào)節(jié)可能是AXL激酶與EGFR下游通路的交叉點(diǎn)。
　　第三部分：AXL在NSCLC細(xì)胞對(duì)gefitinib及do

37、cetaxel藥物反應(yīng)中的作用
　　目的：通過(guò)siRNA干擾技術(shù)敲低A549及H1299細(xì)胞中AXL表達(dá)，或給予AXL激酶抑制劑—R428抑制其激酶活性，觀(guān)察細(xì)胞對(duì)gefitinib及docetaxel反應(yīng)性的影響。此外，從細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡兩方面，初步分析AXL在細(xì)胞對(duì)藥物反應(yīng)中的可能作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
　　人NSCLC細(xì)胞株A549及H1299細(xì)胞株，培養(yǎng)條件及siRNA轉(zhuǎn)染條

38、件同第二部分。
　　2、 siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染聯(lián)合藥物處理細(xì)胞及分組
　　2.1、轉(zhuǎn)染聯(lián)合gefitinib
　　將細(xì)胞分為 Negative control siRNA（NC組）、AXL siRNA、NC+gefitinib、AXLsiRNA+gefitinib四組。按照上述方法培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)加入gefitinib使終濃度為10nM，繼續(xù)作用24小時(shí)收取細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
　　2.2、轉(zhuǎn)染聯(lián)合Do

39、cetaxel
　　將細(xì)胞分為 Negative control siRNA（NC組）、AXL siRNA、NC+Docetaxel、AXLsiRNA+Docetaxel四組。按照上述方法培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)加入Docetaxel使終濃度為20nM，繼續(xù)作用24小時(shí)收取細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
　　3、 R428聯(lián)合藥物處理細(xì)胞及分組
　　3.1、 R428聯(lián)合gefitinib
　　將細(xì)胞分為對(duì)照組、R42

40、8處理組、gefitinib（10nM）、R428聯(lián)合gefitinib四組。按2×104/mL密度將細(xì)胞均勻接種于6孔板中，貼壁后換成含1%血清的RPMI1640培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24h后，加入R428和或gefitinib作用24h收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。
　　3.2、 R428聯(lián)合Docetaxel
　　將細(xì)胞分為對(duì)照組、R428處理組、docetaxel（20nM）、R428聯(lián)合docetaxel（20nM）四組。按2

41、×104/mL密度將細(xì)胞均勻接種于6孔板中，貼壁后換成含1%血清的RPMI1640培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24h后，加入R428和或docetaxel作用24h收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。
　　4、 MTT檢測(cè)
　　2×104個(gè)/孔細(xì)胞均勻接種于96孔板中，貼壁12小時(shí)后，按上述分組經(jīng)不同處理措施后，MTT比色法計(jì)算細(xì)胞存活率。
　　5、 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期分布
　　分別收集不同處理組細(xì)胞，備單細(xì)胞懸液，70%乙醇4℃固定過(guò)

42、夜。PI避光染色30min，1h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，應(yīng)用FlowJo7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　6、 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　分別收集不同處理組細(xì)胞，采用Annexin-V/PI試劑盒，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞在A或D狀態(tài)下的凋亡情況，應(yīng)用FlowJo7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　7、統(tǒng)計(jì)分析
　　所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS Statistics19.0軟件，數(shù)據(jù)分析采用方差分析或T檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±

43、標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、 AXL siRNA干擾聯(lián)合gefitinib對(duì)A549與H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及機(jī)制探討
　　1.1、 MTT檢測(cè)
　　在A549與H1299細(xì)胞中，與NC組相比， AXL siRNA干擾組、NC+gefitinib組及AXL siRNA+gefitinib組細(xì)胞存活率均顯著降低（P＜0.05）。與AXL siRNA干擾組、NC

44、+gefitinib組相比，AXL siRNA+gefitinib組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05）。
　　1.2、 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期分布
　　在A549與H1299細(xì)胞中，與NC組相比，僅AXL siRNA+gefitinib組細(xì)胞G0/G1期比例顯著增多，而G2/M期以及S期細(xì)胞比例顯著減少（P＜0.05）；NC+gefitinib處理對(duì)細(xì)胞周期無(wú)顯著影響。組間比較：AXL siRNA+gefitinib組細(xì)胞G0/

45、G1期比例雖顯著高于NC+gefitinib組（P＜0.05）。
　　1.3、 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　在A549與H1299細(xì)胞中，與NC組相比， NC+gefitinib組及AXL siRNA+gefitinib組細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。組間比較，AXL siRNA+gefitinib組細(xì)胞凋亡率顯著高于AXL siRNA組及NC+gefitinib組（P＜0.05）。
　　2. R428聯(lián)合gefi

46、tinib對(duì)A549與H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及機(jī)制探討
　　2.1、 MTT檢測(cè)
　　在A549與H1299細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，R428處理組、gefitinib組以及R428聯(lián)合gefitinib組細(xì)胞存活率均明顯被抑制（P＜0.05）。組間比較：R428聯(lián)合gefitinib組細(xì)胞存活率最低，明顯低于gefitinib組和R428干預(yù)組（P＜0.05）。
　　2.2、 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期分布
　　在A54

47、9與H1299細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，R428處理組、R428聯(lián)合gefitinib組細(xì)胞G0/G1期比例顯著增多，G2/M期、S其細(xì)胞比例相應(yīng)減少（P＜0.05）。組間比較：R428聯(lián)合gefitinib組細(xì)胞G0/G1期比例雖顯著高于gefitinib組（P＜0.05）。
　　2.3 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　在A549與H1299細(xì)胞中，與對(duì)照組相比， gefitinib處理組、R428聯(lián)合gefitinib組細(xì)胞凋亡率顯

48、著增加（P＜0.05）。組間比較：R428聯(lián)合gefitinib處理組細(xì)胞凋亡率較R428處理組、gefitinib處理組均顯著增加（P＜0.05）。
　　3.AXL siRNA干擾聯(lián)合Docetaxel對(duì)A549和H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及機(jī)制探討:
　　3.1、 MTT檢測(cè)
　　在 A549與 H1299細(xì)胞中，與 NC相比， AXL siRNA干擾組、NC+docetaxel組及AXL siRNA+docetax

49、el組細(xì)胞存活率均出現(xiàn)不同程度降低（P＜0.05）。組間比較：在A549細(xì)胞中AXL siRNA+docetaxel組細(xì)胞存活率低于NC+docetaxel組與AXL siRNA干擾組（P＜0.05）。在H1299細(xì)胞中，聯(lián)合用藥組與單獨(dú)處理組均無(wú)顯著差異。
　　3.2、 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期分布
　　在A549與H1299細(xì)胞中，與NC組相比，NC+docetaxel組細(xì)胞處于G2/M期比例顯著增加G0/G1期細(xì)胞比例則顯著

50、降低提示docetaxel可引起細(xì)胞發(fā)生G2/M期周期阻滯。組間比較：與NC+docetaxel相比，在A549細(xì)胞中AXL siRNA+docetaxel處理組細(xì)胞G2/M期比例顯著降低，而G0/G1期細(xì)胞則顯著增加（P＜0.05）。在H1299細(xì)胞中，NC+docetaxel與AXL siRNA+docetaxel組相比，各期細(xì)胞比例無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　　3.3、 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　在A549與H129

51、9細(xì)胞中，與NC組相比，NC+docetaxel組及AXL siRNA+docetaxel組細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。組間比較：AXL siRNA+docetaxel組細(xì)胞凋亡率顯著高于AXL siRNA組（P＜0.05）。4 R428聯(lián)合docetaxel對(duì)A549和H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及機(jī)制探討:
　　4.1、 MTT檢測(cè)：
　　在A549和H1299細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，R428處理組、docetaxe

52、l處理組、R428聯(lián)合docetaxel處理組細(xì)胞活存率均降低（P＜0.05）。組間比較：R428聯(lián)合docetaxel組細(xì)胞存活率最低，顯著低于docetaxel組和R428處理組（P＜0.05）。
　　4.2、 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期分布
　　在A549和H1299細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，docetaxel處理組細(xì)胞處于G2/M期比例顯著增加G0/G1期細(xì)胞比例則顯著降低（P＜0.05）；R428處理組細(xì)胞G0/G1期比例顯著

53、增多，G2/M期、S期細(xì)胞比例相應(yīng)減少（P＜0.05）。組間比較：與單獨(dú)docetaxel組相比，R428聯(lián)合docetaxel處理組細(xì)胞G2/M期比例顯著降低，而G0/G1期細(xì)胞則相應(yīng)顯著增加（P＜0.05）。4.3 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　在A549和H1299細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，docetaxel組及R428聯(lián)合docetaxel處理組細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。組間比較： R428聯(lián)合docetaxel處理組細(xì)

54、胞凋亡率顯著高于R428處理組（P＜0.05）。
　　小結(jié)：
　　1、 Gefitinib處理A549與H1299細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞周期影響不顯著，但可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞的增殖活性。
　　2、 Docetaxel處理A549與H1299細(xì)胞，可引起明顯的G2/M期周期阻滯，發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。
　　3、 AXL siRNA轉(zhuǎn)染/R428聯(lián)合gefitinib處理，對(duì)A549與H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

55、高于單獨(dú)處理組，其對(duì)生長(zhǎng)的抑制與引起細(xì)胞G0/G1阻滯或促進(jìn)凋亡相關(guān)。
　　4、 R428聯(lián)合docetaxel處理對(duì)A549與H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用高于單獨(dú)處理組，其抑制作用與引起細(xì)胞G0/G1、G2/M期細(xì)胞周期阻滯或促進(jìn)凋亡相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、109例肺腺癌組織中，EGFR19外顯子缺失突變、21外顯子L858R突變的發(fā)生率較高（62.4%），而20外顯子T790M原發(fā)突變僅為1.83%。
　

56、　2、109例肺腺癌病例中，AXL蛋白表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組病例中顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；EGFR蛋白表達(dá)與腺癌亞型、腫瘤大小及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)；pEGFR1068蛋白表達(dá)與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。
　　3、 AXL表達(dá)與EGFR突變狀態(tài)間無(wú)顯著相關(guān)性；EGFR、pEGFR1068表達(dá)與EGFR21外顯子 L858R點(diǎn)突變顯著相關(guān)，而且pEGFR1068在攜帶19 Del或L858R突變患者表達(dá)顯著增加，提示EGFR Tyr-106

57、8位點(diǎn)磷酸化與EGFR敏感突變有關(guān)。
　　4、 AXL+/EGFR+/pEGFR1068共表達(dá)率在EGFR突變組顯著高于野生型肺腺癌患者，表明在部分原發(fā)肺腺癌病例中AXL與EGFR通路間存在共表達(dá)情況。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，p-AKT作為AXL與EGFR共同的下游信號(hào)分子，AXL對(duì)p-AKT的調(diào)節(jié)可能是AXL激酶與EGFR下游通路的交叉點(diǎn)之一。
　　5、轉(zhuǎn)染AXL siRNA或給予20nM AXL激酶抑制劑-R428處理A54

58、9與H1299細(xì)胞，可顯著抑制細(xì)胞的增殖活性，其機(jī)制與細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯或促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。同時(shí)，抑制AXL可顯著降低細(xì)胞的遷移能力。
　　6、 Gefitinib或docetaxel單獨(dú)處理A549與H1299細(xì)胞，可顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。其中g(shù)efitinib可促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而抑制細(xì)胞的增殖活性，而docetaxel可引起明顯的G2/M期周期阻滯，發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。
　　7、 AXL siRNA轉(zhuǎn)染/R42