核酸探針技術(shù)用于mRNA檢測(cè)的研究.pdf

1、實(shí)時(shí)獲取RNA合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、表達(dá)、定位的信息對(duì)分子生物學(xué)、病理生理學(xué)、藥物的開(kāi)發(fā)及疾病的診斷等研究都具有重要的推動(dòng)作用。核酸熒光分子探針為RNA研究提供了一種強(qiáng)有力的工具，己為我們提供了大量有關(guān)RNA的基本信息。但是，如何進(jìn)一步拓展已有核酸分子探針在生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用范圍，如何進(jìn)一步改進(jìn)或研制新的核酸分子探針來(lái)解決生命研究過(guò)程中遇到的新問(wèn)題，如何實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、靈敏、準(zhǔn)確地獲取生命活動(dòng)相關(guān)信息，仍然是分析化學(xué)工作者所面臨的重大挑戰(zhàn)。

2、 本論文瞄準(zhǔn)上述挑戰(zhàn)進(jìn)行研究，結(jié)合分子信標(biāo)和相鄰探針技術(shù)建立了一系列檢測(cè)mRNA的新方法，主要內(nèi)容包括： 1．建立了一種直接以mRNA為模板，基于Reverse分子信標(biāo)檢測(cè)單堿基突變的新方法。本文以重要的腫瘤相關(guān)基因p53為檢測(cè)對(duì)象，利用T4 DNA連接酶的高特異性、以及RNase H對(duì)RNA/DNA雜交體中RNA鏈的降解作用，結(jié)合Reverse分子信標(biāo)技術(shù)，發(fā)展了一種快速檢測(cè)靶基因mRNA單堿基突變的新方法。該方法通過(guò)比

3、較分析RNase H作用前后樣品中熒光信號(hào)的變化，確定是否存在單堿基突變。這種方法探針設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，避免了反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增、電泳分離等步驟，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，已應(yīng)用于細(xì)胞總RNA提取物中目標(biāo)基因的單堿基錯(cuò)配檢測(cè)。 2．設(shè)計(jì)合成了超猝滅分子信標(biāo)。提高分子信標(biāo)的猝滅效率是優(yōu)化分子信標(biāo)檢測(cè)性能，提高其檢測(cè)靈敏度的有效途徑之一。本文設(shè)計(jì)、合成、純化了常規(guī)分子信標(biāo)和超淬滅分子信標(biāo)，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行解析，證明其為目

4、標(biāo)產(chǎn)物。與相同序列的常規(guī)分子信標(biāo)相比，超淬滅分子信標(biāo)的信背比可達(dá)到112，比常規(guī)分子信標(biāo)大約高5倍，信背比的提高主要是通過(guò)降低背景信號(hào)達(dá)到的。研究還表明，與熒光基團(tuán)相鄰的末端為C堿基，或者在探針末端引入與目標(biāo)互補(bǔ)的序列，也可以提高超猝滅分子信標(biāo)的檢測(cè)靈敏度。 3．建立了基于硫代修飾相鄰探針直接檢測(cè)細(xì)胞裂解液中mRNA的新方法。常規(guī)相鄰探針用于生物樣品中核酸檢測(cè)時(shí)，有可能被核酸酶降解而產(chǎn)生假陰性信號(hào)。本文設(shè)計(jì)了一種硫代修飾的相鄰

5、探針，并用于細(xì)胞裂解液中相關(guān)mRNA的檢測(cè)。結(jié)果表明，硫代修飾探針可以有效抵御核酸酶的降解作用，降低假陽(yáng)性信號(hào)及假陰性信號(hào)。探針設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、靈敏度高、與靶分子作用速度快；檢測(cè)過(guò)程中信號(hào)呈逐漸增強(qiáng)模式、可免除洗脫及分離等步驟。 4．建立了基于分子信標(biāo)熒光增強(qiáng)速率檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)的新方法。常規(guī)分子信標(biāo)在活細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)水平的研究中，由于細(xì)胞內(nèi)核酸酶對(duì)分子信標(biāo)骨架的降解和破壞作用，常導(dǎo)致假陽(yáng)性信號(hào)的產(chǎn)生，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性

6、影響較大。本文根據(jù)腫瘤抑制基因p21序列設(shè)計(jì)合成分子信標(biāo)，通過(guò)顯微操作將其注入p21表達(dá)水平存在差異的兩種鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)，以活細(xì)胞成像方式動(dòng)態(tài)檢測(cè)了分子信標(biāo)進(jìn)入鼻咽癌細(xì)胞后熒光信號(hào)的變化。p21分子信標(biāo)注入兩種細(xì)胞后，熒光信號(hào)均逐漸增強(qiáng)，約15 min后達(dá)到最大值；注入細(xì)胞后4 min內(nèi)，兩種細(xì)胞間熒光增強(qiáng)速率存在明顯差異，該差異反映了p21 mRNA表達(dá)水平的變化趨勢(shì)，與常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT—PCR)結(jié)果相符。在使用分子信標(biāo)進(jìn)行活細(xì)胞

7、內(nèi)mRNA表達(dá)水平的研究中，通過(guò)分析熒光增強(qiáng)速率的變化，可有效降低細(xì)胞內(nèi)的酶的影響，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 5．建立了基于硫代修飾分子信標(biāo)檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)的新方法。本文針對(duì)分子信標(biāo)在活細(xì)胞檢測(cè)中所面臨的生物穩(wěn)定性的關(guān)鍵問(wèn)題，用可抵御核酸酶切的硫代修飾的DNA設(shè)計(jì)合成分子信標(biāo)探針，提高了細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)還可保持常規(guī)分子信標(biāo)高選擇性、高靈敏度以及無(wú)需對(duì)多余探針洗脫的優(yōu)點(diǎn)。該分子信標(biāo)已應(yīng)用于轉(zhuǎn)染GFP基因前后活細(xì)