核酸探針技術用于mRNA檢測的研究.pdf

1、實時獲取RNA合成、轉運、表達、定位的信息對分子生物學、病理生理學、藥物的開發(fā)及疾病的診斷等研究都具有重要的推動作用。核酸熒光分子探針為RNA研究提供了一種強有力的工具，己為我們提供了大量有關RNA的基本信息。但是，如何進一步拓展已有核酸分子探針在生命科學與醫(yī)學中的應用范圍，如何進一步改進或研制新的核酸分子探針來解決生命研究過程中遇到的新問題，如何實時、動態(tài)、靈敏、準確地獲取生命活動相關信息，仍然是分析化學工作者所面臨的重大挑戰(zhàn)。

2、 本論文瞄準上述挑戰(zhàn)進行研究，結合分子信標和相鄰探針技術建立了一系列檢測mRNA的新方法，主要內容包括： 1．建立了一種直接以mRNA為模板，基于Reverse分子信標檢測單堿基突變的新方法。本文以重要的腫瘤相關基因p53為檢測對象，利用T4 DNA連接酶的高特異性、以及RNase H對RNA/DNA雜交體中RNA鏈的降解作用，結合Reverse分子信標技術，發(fā)展了一種快速檢測靶基因mRNA單堿基突變的新方法。該方法通過比

3、較分析RNase H作用前后樣品中熒光信號的變化，確定是否存在單堿基突變。這種方法探針設計簡單，避免了反轉錄、PCR擴增、電泳分離等步驟，檢測結果準確，已應用于細胞總RNA提取物中目標基因的單堿基錯配檢測。 2．設計合成了超猝滅分子信標。提高分子信標的猝滅效率是優(yōu)化分子信標檢測性能，提高其檢測靈敏度的有效途徑之一。本文設計、合成、純化了常規(guī)分子信標和超淬滅分子信標，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜對產(chǎn)物進行解析，證明其為目

4、標產(chǎn)物。與相同序列的常規(guī)分子信標相比，超淬滅分子信標的信背比可達到112，比常規(guī)分子信標大約高5倍，信背比的提高主要是通過降低背景信號達到的。研究還表明，與熒光基團相鄰的末端為C堿基，或者在探針末端引入與目標互補的序列，也可以提高超猝滅分子信標的檢測靈敏度。 3．建立了基于硫代修飾相鄰探針直接檢測細胞裂解液中mRNA的新方法。常規(guī)相鄰探針用于生物樣品中核酸檢測時，有可能被核酸酶降解而產(chǎn)生假陰性信號。本文設計了一種硫代修飾的相鄰

5、探針，并用于細胞裂解液中相關mRNA的檢測。結果表明，硫代修飾探針可以有效抵御核酸酶的降解作用，降低假陽性信號及假陰性信號。探針設計簡單、靈敏度高、與靶分子作用速度快；檢測過程中信號呈逐漸增強模式、可免除洗脫及分離等步驟。 4．建立了基于分子信標熒光增強速率檢測活細胞內mRNA表達的新方法。常規(guī)分子信標在活細胞內mRNA表達水平的研究中，由于細胞內核酸酶對分子信標骨架的降解和破壞作用，常導致假陽性信號的產(chǎn)生，對檢測結果的準確性

6、影響較大。本文根據(jù)腫瘤抑制基因p21序列設計合成分子信標，通過顯微操作將其注入p21表達水平存在差異的兩種鼻咽癌細胞內，以活細胞成像方式動態(tài)檢測了分子信標進入鼻咽癌細胞后熒光信號的變化。p21分子信標注入兩種細胞后，熒光信號均逐漸增強，約15 min后達到最大值；注入細胞后4 min內，兩種細胞間熒光增強速率存在明顯差異，該差異反映了p21 mRNA表達水平的變化趨勢，與常規(guī)逆轉錄PCR(RT—PCR)結果相符。在使用分子信標進行活細胞

7、內mRNA表達水平的研究中，通過分析熒光增強速率的變化，可有效降低細胞內的酶的影響，提高檢測結果的準確性。 5．建立了基于硫代修飾分子信標檢測活細胞內mRNA表達的新方法。本文針對分子信標在活細胞檢測中所面臨的生物穩(wěn)定性的關鍵問題，用可抵御核酸酶切的硫代修飾的DNA設計合成分子信標探針，提高了細胞內檢測結果的準確性，同時還可保持常規(guī)分子信標高選擇性、高靈敏度以及無需對多余探針洗脫的優(yōu)點。該分子信標已應用于轉染GFP基因前后活細