斑點叉尾鮰皰疹病毒核酸探針檢測方法的研究.pdf

1、本文對斑點叉尾鮰皰疹病毒核酸探針檢測方法進行了研究。采用PCR方法制備地高辛標記DNA探針，分別建立了CCV PCR-ELISA檢測方法和斑點雜交檢測方法，主要結果如下：
　　 1．根據(jù)CCV的ORF6基因設計引物和捕獲探針，其中捕獲探針的5’端標記生物素，PCR產物在擴增過程中標記地高辛，利用經鏈親和素包被的聚苯乙烯96孔酶標板固相雜交檢測PCR產物，建立了CCV的PCR-ELISA檢測方法。
　　 2．進行PCR反應

2、條件的優(yōu)化，結果表明：優(yōu)化的PCR反應條件為25μL反應體系：1×PCR緩沖液、0.4 mmol/L dNTP、4 mmol/L Mg2+、上下游引物各0.4 mmol/L、Tag DNA聚合酶1.0 U、模板1μL、用滅菌去離子水補足體積25μL。PCR擴增條件為：95℃預變性5 min、94℃30 s、58℃45 s、72℃30 s、35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保溫。在最優(yōu)的PCR反應條件下，將dNTP替換為DIG-dN

3、TP，進行PCR產物標記反應，電泳結果表明成功將PCR產物標記上地高辛。
　　 3．建立PCR產物的固相雜交檢測程序，并進行雜交條件的優(yōu)化，結果表明最優(yōu)的固相雜交檢測參數(shù)為：最優(yōu)探針包被濃度為50 pmol/mL；最優(yōu)的雜交溫度為42℃；最優(yōu)的雜交時間為90 min。
　　 4．方法的特異性和敏感度檢測實驗表明：反應特異性強，與各對照均無交叉反應；反應敏感度為5fg CCV DNA。
　　 5．利用所建立的檢測方