microRNA-15b在乙型肝炎病毒復(fù)制中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)感染宿主后，HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(HBV cccDNA)可整合入宿主細(xì)胞的染色體中，并能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制，可形成慢性持續(xù)性感染狀態(tài)。對(duì)于HBV的治療，雖然臨床上應(yīng)用干擾素α和核苷類似物治療HBV感染，能夠一定程度上抑制病毒復(fù)制，但是由于病毒突變和HBV cccDNA的存在，這些藥物不能產(chǎn)生持續(xù)的抗病毒免疫應(yīng)答，不能夠徹底清除肝細(xì)胞內(nèi)的乙肝病毒。抑制宿主體內(nèi)HBV病毒復(fù)制，降低其致病性，需要深入分析HBV-宿主

2、的之間的相互作用，研究病毒復(fù)制調(diào)控的機(jī)制。近年來的研究表明，microRNA(miRNA)是病毒與宿主相互作用的一類新的調(diào)控分子，在病毒的復(fù)制及致病中發(fā)揮重要的作用。深入研究miRNA在HBV復(fù)制及致病中的作用，有利于進(jìn)一步闡明HBV與宿主的相互作用，并為發(fā)展新型的抗HBV藥物提供新的靶點(diǎn)和策略。
　　為了探索HBV復(fù)制相關(guān)的miRNA，我們首先利用不同HBV復(fù)制表達(dá)水平的細(xì)胞系，通過生物芯片分析，篩選可能與HBV復(fù)制相關(guān)的miR

3、NA。然后通過研究miRNA與HBV復(fù)制之間的相互關(guān)系及分子機(jī)制，闡明miRNA在HBV-宿主相互關(guān)系中的作用。
　　1.miR-15b對(duì)HBV復(fù)制與表達(dá)的影響研究
　　(1) HBV復(fù)制相關(guān)miRNA的篩選及鑒定
　　為了探索HBV復(fù)制相關(guān)的miRNA，我們用HepG2細(xì)胞系、HepG2.2.15細(xì)胞系、HepAd38細(xì)胞系分別作為無HBV復(fù)制細(xì)胞模型、HBV低復(fù)制細(xì)胞模型、HBV高復(fù)制細(xì)胞模型，通過miRNA生物芯

4、片分析這三種細(xì)胞系中miRNA表達(dá)水平的變化，選擇6個(gè)隨病毒復(fù)制表達(dá)增加而逐漸降低的miRNA，作為可能與HBV復(fù)制相關(guān)的候選miRNA。然后將miRNA模擬物轉(zhuǎn)染入瞬時(shí)表達(dá)HBV的細(xì)胞中，通過檢測(cè)HBeAg表達(dá)水平的變化，篩選HBV復(fù)制相關(guān)的miRNA，結(jié)果表明:僅有miR-15b能夠促進(jìn)HBeAg的表達(dá)，其他miRNA對(duì)HBeAg表達(dá)無顯著影響。因此我們選擇miR-15b作為研究對(duì)象，研究其在HBV復(fù)制中的作用及分子機(jī)制。
　

5、　(2) miR-15b對(duì)HBV復(fù)制與表達(dá)的影響
　　我們通過在胞外分泌的HBeAg、 HBsAg、 HBV DNA以及胞內(nèi)HBV RNA、HBV復(fù)制中間體等水平檢測(cè)miR-15b對(duì)HBV復(fù)制及蛋白表達(dá)的影響。在HBV瞬時(shí)表達(dá)的Huh7細(xì)胞以及HBV穩(wěn)定表達(dá)的HepG2.2.15細(xì)胞中，miR-15b過表達(dá)能夠促進(jìn)HBV的復(fù)制與表達(dá);抑制內(nèi)源性miR-15b的表達(dá)能夠降低HBV的復(fù)制與表達(dá)。為了在體內(nèi)水平檢測(cè)miR-15b對(duì)HBV

6、復(fù)制的影響，我們使用重組8型腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的乙型肝炎病毒持續(xù)感染小鼠模型，通過高壓水動(dòng)力法將miR-15b抑制性載體注射入小鼠體內(nèi)，檢測(cè)HBVDNA，結(jié)果顯示:抑制內(nèi)源性miR-15b的表達(dá)后小鼠血清中HBV DNA拷貝數(shù)降低。上述結(jié)果說明:miR-15b可以促進(jìn)HBV的復(fù)制與表達(dá)。
　　2.miR-15b調(diào)節(jié)HBV復(fù)制與表達(dá)的分子機(jī)制研究
　　(1)研究miR-15b調(diào)控HBV復(fù)制與表達(dá)是否通過直接靶向HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物而

7、實(shí)現(xiàn)
　　miRNA可能通過直接靶向HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者靶向HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中重要的調(diào)控因子這兩種方式調(diào)控HBV的復(fù)制與表達(dá)。首先通過生物信息學(xué)分析miR-15b是否能夠直接靶向HBV基因組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HBV基因組上存在一個(gè)miR-15b可能的靶位點(diǎn)(417 nt-423 nt)，將含此位點(diǎn)的序列構(gòu)建入miRNA靶基因鑒定的報(bào)告基因載體中，與miR-15b mimics共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，報(bào)告基因結(jié)果顯示:miR-15b并不影響報(bào)告基因

8、活性，即miR-15b不能通過直接靶向HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物而影響病毒的復(fù)制。
　　(2)研究miR-15b調(diào)控HBV復(fù)制與表達(dá)是否通過靶向HBV復(fù)制調(diào)控相關(guān)因子而實(shí)現(xiàn)
　　排除了miR-15b通過直接靶向HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物影響病毒復(fù)制的可能性，分析miR-15b可能通過靶向病毒復(fù)制相關(guān)的因子影響病毒復(fù)制。HBV復(fù)制過程中cccDNA合成以及以cccDNA為模板進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)錄是病毒復(fù)制的重要調(diào)控環(huán)節(jié)。HBV轉(zhuǎn)錄過程中啟動(dòng)子與增強(qiáng)子等調(diào)控

9、元件以及轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。排除了miR-15b直接靶向HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的可能性，推測(cè)miR-15b可能是通過影響HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而影響啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子活性，進(jìn)而調(diào)控HBV的復(fù)制與表達(dá)。我們分析miR-15b對(duì)HBV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的影響。將HBV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子基因建入報(bào)告基因載體pGL3-Basic中，與miR-15bmimics共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，報(bào)告基因的結(jié)果說明:miR-15b能促進(jìn)HBV增強(qiáng)子Ⅰ(HBV

10、 EnhancerⅠ)的活性，而對(duì)其他調(diào)控元件不影響。我們推測(cè)miR-15b可能靶向調(diào)控HBV EnhancerⅠ活性的轉(zhuǎn)錄因子，從而影響其活性。生物信息學(xué)分析既是miR-15b的靶基因，又可以結(jié)合HBV EnhancerⅠ的分子，結(jié)果提示:肝細(xì)胞核因子1α(HNF1α)可能既是miR-15b靶分子，又是HBV EnhancerⅠ的結(jié)合分子，即HNF1α可能是miR-15b促進(jìn)HBV EnhancerⅠ活性的中介分子。
　　(3)

11、miR-15b靶基因的驗(yàn)證
　　為了檢測(cè)HNF1α是否為miR-15b的靶基因，我們將HNF1α3'UTR及其靶位點(diǎn)突變的HNF1α3'UTR構(gòu)建入靶基因鑒定的報(bào)告基因載體中，與miR-15b mimics共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，報(bào)告基因結(jié)果顯示:miR-15b能夠降低含有HNF1α3'UTR的報(bào)告基因活性，而不能影響靶位點(diǎn)突變的報(bào)告基因活性，這說明miR-15b能夠直接靶向HNF1α3'UTR。為了進(jìn)一步研究miR-15b對(duì)細(xì)胞中HNF1α

12、 mRNA及蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-15b過表達(dá)抑制了HNF1α mRNA以及蛋白表達(dá);而抑制內(nèi)源性miR-15b則促進(jìn)了HNF1α mRNA以及蛋白表達(dá)。在小鼠體內(nèi)獲得了同樣的結(jié)果。上述結(jié)果表明HNF1α是miR-15b的靶基因。
　　(4) HNF1α對(duì)HBV復(fù)制與表達(dá)的調(diào)控作用研究
　　生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明HBV EnhancerⅠ含有HNF1α結(jié)合位點(diǎn)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)分析結(jié)果，我們將HBV En

13、hancerⅠ及其靶位點(diǎn)突變的HBV EnhancerⅠ構(gòu)建入報(bào)告基因載體pGL3-Basic中，與HNF1α表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，報(bào)告基因結(jié)果顯示:HNF1α能夠降低HBV EnhancerⅠ的報(bào)告基因活性，而不能影響靶位點(diǎn)突變的報(bào)告基因活性，這說明HNF1α能夠直接靶向HBV EnhancerⅠ。進(jìn)一步研究HNF1α對(duì)HBV復(fù)制及表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中過表達(dá)HNF1α可以抑制HBV復(fù)制及蛋白表達(dá);而抑制內(nèi)源性HNF1α表達(dá)則可

14、以促進(jìn)HBV復(fù)制及蛋白表達(dá)。以上結(jié)果說明HNF1α能夠直接靶向HBV EnhancerⅠ，通過抑制HBV EnhancerⅠ活性抑制HBV的復(fù)制和基因表達(dá)。
　　(5) HNF1α是miR-15b促進(jìn)HBV復(fù)制與表達(dá)的中介分子
　　上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明HNF1α是miR-15b的靶基因，并且HNF1α能夠通過直接抑制HBV EnhancerⅠ活性來抑制HBV復(fù)制和基因表達(dá)，據(jù)此推測(cè)miR-15b可能直接靶向抑制HNF1α從而促

15、進(jìn)HBV EnhancerⅠ的活性，最終促進(jìn)HBV復(fù)制與表達(dá)。為了驗(yàn)證我們的猜想，我們利用雙報(bào)告基因系統(tǒng)研究了HNF1α在miR-15b促進(jìn)EnhancerⅠ活性中所起的作用，報(bào)告基因的結(jié)果表明，miR-15b促進(jìn)了HBV EnhancerⅠ的報(bào)告基因活性，但是外源加入HNF1α后，抵消了miR-15b對(duì)EnhancerⅠ的促進(jìn)作用。同樣的，在HBV瞬時(shí)表達(dá)的Huh7細(xì)胞中，miR-15b能夠促進(jìn)HBeAg、 HBsAg的表達(dá)，但是外源

16、加入HNF1α后則抵消了miR-15b對(duì)HBV抗原表達(dá)的促進(jìn)作用。以上結(jié)果表明，HNF1α是miR-15b促進(jìn)HBV EnhancerⅠ活性以及促進(jìn)HBV復(fù)制表達(dá)的中介分子。
　　3.HBV感染宿主細(xì)胞對(duì)miR-15b表達(dá)的影響研究
　　在前期的芯片結(jié)果及實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)隨著HBV復(fù)制水平的升高，miR-15b表達(dá)逐漸降低。為了檢測(cè)HBV是否調(diào)控miR-15b的表達(dá)，我們?cè)诩?xì)胞和動(dòng)物水平分別檢測(cè)HBV的復(fù)制與表達(dá)對(duì)miR-1

17、5b表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)HBV能夠抑制miR-15b的表達(dá)。進(jìn)一步研究HBV編碼蛋白對(duì)miR-15b表達(dá)的影響，在瞬時(shí)表達(dá)HBV編碼蛋白的細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)HBV編碼的HBx蛋白能夠抑制miR-15b表達(dá)，而其他HBV編碼蛋白不影響miR-15b表達(dá)。檢測(cè)miR-15b在HBx轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)HBx轉(zhuǎn)基因小鼠中miR-15b的表達(dá)隨時(shí)間進(jìn)展逐漸降低。以上結(jié)果說明:HBV病毒的X蛋白抑制宿主細(xì)胞的miR-15b表達(dá)。
　　

18、我們的研究說明:miR-15b能夠通過直接靶向HBV EnhancerⅠ的負(fù)調(diào)控因子HNF1α從而促進(jìn)了HBV EnhancerⅠ的活性，最終促進(jìn)了HBV的復(fù)制與表達(dá);另一方面，HBV特別是HBx的表達(dá)，能夠使細(xì)胞內(nèi)miR-15b的表達(dá)水平降低。HBV與miR-15b之間存在著負(fù)反饋調(diào)控作用。HBV通過負(fù)調(diào)控其復(fù)制促進(jìn)因子miR-15b，負(fù)反饋調(diào)節(jié)自身復(fù)制，從而避免復(fù)制失控而被免疫系統(tǒng)識(shí)別。miR-15b與HBV之間互相調(diào)節(jié)在控制HBV