秋水仙堿配合SrCl2對小鼠卵母細胞去核效果及其機制研究.pdf

1、使用脫羰秋水仙堿（demecolcine）誘導(dǎo)卵母細胞去核能提高去核效率，降低去核操作復(fù)雜性，并由此獲得了克隆動物。但是近幾年市面上已經(jīng)很難買到脫羰秋水仙堿，所以需要尋找新的藥物替代。我們用其類似物秋水仙堿（colchicine）（一種微管結(jié)構(gòu)破壞劑）誘導(dǎo)小鼠卵母細胞去核，研究乙醇和SrCl2兩種激活處理方法對秋水仙堿誘導(dǎo)去核效率的影響，并摸索秋水仙堿誘導(dǎo)去核過程中最佳處理濃度和作用時間，篩選最佳去核方案。采用免疫熒光技術(shù)觀察比較秋水仙

2、堿作用于激活卵母細胞和未激活卵母細胞的微管結(jié)構(gòu)不同之處。為了評價秋水仙堿處理對卵母細胞質(zhì)量的影響，本研究利用酶聯(lián)免疫、定量PCR和熒光染色法檢測了卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)MPF活性（與核重編程和細胞周期相關(guān)）、ROS濃度（與氧化應(yīng)激相關(guān)）及Bcl-2（與細胞凋亡相關(guān)）表達量的變化。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴SrCl2激活組和乙醇激活組在配合0.6μg/mL秋水仙堿處理卵母細胞60min后獲得最高去核率，兩者之間差異顯著(34.38％，25

3、.36％)(P＜0.05)，乙醇激活組中部分未成功去核的卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)含有核碎片。我們猜測SrCl2和乙醇對卵母細胞激活機制的不同是導(dǎo)致去核率差異顯著的原因。⑵免疫熒光結(jié)果顯示，完全去核卵母細胞呈現(xiàn)兩種形態(tài)，一種是染色體隨第二極體完全排出，一種是染色體全部存在于卵母細胞皮質(zhì)層形成的突起內(nèi)。而突起部分會隨著秋水仙堿處理時間的延長發(fā)生回縮進胞質(zhì)的現(xiàn)象，這可能是導(dǎo)致秋水仙堿去核率較低的原因。⑶秋水仙堿處理已激活卵母細胞后，胞質(zhì)中微管結(jié)構(gòu)徹底消

4、失，而處理未激活卵母細胞后，微管結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，但不會消失，該結(jié)果表明激活卵母細胞會協(xié)助秋水仙堿破壞微管結(jié)構(gòu)。⑷秋水仙堿處理卵母細胞能夠在整體上顯著提高MPF活性值(P＜0.05)，抑制cyclinB1的水解，說明秋水仙堿處理能提高卵母細胞核重編程能力。⑸秋水仙堿處理未激活卵母細胞會顯著提高卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)ROS濃度(P＜0.05)，且導(dǎo)致Bcl-2表達異常，而處理已激活卵母細胞會降低ROS濃度(P＞0.05)，且Bcl-2表達量較對照組顯