Gli通過PI3K-AKT途徑促進(jìn)食管鱗癌KYSE-30細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、目的：食管癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別占我國惡性腫瘤的第5位和第4位，我國食管癌的病理類型以食管鱗狀細(xì)胞癌為主。由于早期食管癌的癥狀不明顯，一旦確診后多為中晚期，即使采取以手術(shù)、放化療為主的綜合治療，其遠(yuǎn)期治療效果并沒有明顯改善，近年來針對腫瘤發(fā)病的分子學(xué)機(jī)制采取特異性的靶向治療成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)，Hedgehog（Hh）信號通路在胚胎期調(diào)控多種細(xì)胞的分化和生長，對維持成熟器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及人類多種惡性腫瘤的發(fā)

2、展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Gli作為Hh信號通路下游調(diào)控中心，其異常激活可以啟動(dòng)下游多種腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。最近研究表明，Gli基因在人類基底細(xì)胞癌、乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中被異常激活并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。PI3K通過磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidvlinositol-3-kinases,PI3K）是細(xì)胞內(nèi)重要信號通路之一，主要通過活化下游的靶蛋白AKT參與細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移過程。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epi

3、thelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮型細(xì)胞在特定的生理或病理情況下向間質(zhì)型細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的過程，是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。有研究發(fā)現(xiàn)Hh通路可以通過影響PI3K通路進(jìn)而影響EMT過程促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，但目前國內(nèi)外關(guān)于食管鱗癌中Gli是否通過PI3K/AKT通路調(diào)控EMT過程尚無明確結(jié)果，因此本研究主要探討Gli調(diào)節(jié)食管鱗癌KYSE-30細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenc

4、hymal transition,EMT）的分子學(xué)機(jī)制，尋找有效治療食管鱗癌的分子靶向藥物。
　　方法：實(shí)時(shí)熒光定量PCR法觀察GANT61處理KYSE-30細(xì)胞24h后對Gli1、Gli2、Vimentin和N-cadherin mRNA表達(dá)的影響；Western blot試驗(yàn)觀察GANT61處理KYSE-30細(xì)胞24h后對Gli1、Gli2、p-AKT、AKT、Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)的影響；Transw

5、ell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察GANT61抑制Gli1和Gli2表達(dá)后對食管鱗癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響；應(yīng)用N-Shh活化KYSE-30細(xì)胞24小時(shí)后，對相應(yīng)Gli1、Gli2、Vimentin和N-cadherinmRNA及相應(yīng)蛋白及AKT、p-AKT蛋白進(jìn)行測定，并通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)研究對其侵襲能力的影響，同時(shí)還應(yīng)用 GANT61&N-Shh作用KYSE-30細(xì)胞24小時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法觀察KYSE-30細(xì)胞中Gli1、Gli

6、2、Vimentin和N-cadherin mRNA表達(dá)量的變化；Western blot試驗(yàn)觀察KYSE-30細(xì)胞中Gli1、Gli2、p-AKT、AKT、Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)的變化；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察GANT61&N-Shh組對食管鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.Gli抑制劑GANT61組與DMSO對照組相比可以顯著下調(diào)食管鱗癌KYSE-30細(xì)胞的Gli1、Gli2

7、、Vimentin和N-cadherin mRNA表達(dá)(P均<0.01)；Western blot顯示GANT61可以下調(diào)KYSE-30的Gli1、Gli2、p-AKT、Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)(P均<0.01)，而AKT蛋白表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示GANT61可以顯著抑制KYSE-30細(xì)胞的侵襲能力(P<0.01)。
　　2.應(yīng)用Gli激動(dòng)劑N-Shh組可以顯著上調(diào)

8、食管鱗癌KYSE-30細(xì)胞的Gli1、Gli2、Vimentin和N-cadherin mRNA，mRNA表達(dá)(P均<0.01)，Western blot顯示N-Shh可以上調(diào)KYSE-30的Gli1、Gli2、p-AKT、Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)(P均<0.01)，而 AKT蛋白表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）； Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)N-Shh可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力(P<0.01)。
　　3

9、.GANT61&N-Shh組與 GANT61組相比上調(diào)了 KYSE-30細(xì)胞的Gli1、Gli2、Vimentin和N-cadherin mRNA表達(dá)(P均<0.01)；Western blot顯示同樣上調(diào)了KYSE-30的Gli1、Gli2、p-AKT、Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)(P均<0.01)，而AKT蛋白表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示GANT61&N-Shh組與GANT61

10、組相比促進(jìn)了KYSE-30細(xì)胞的侵襲能力(P<0.01)。
　　結(jié)論：在食管鱗狀細(xì)胞癌中Gli的表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程密切相關(guān)， Gli可能通過PI3K/AKT途徑促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。Gli1和Gli2表達(dá)降低可以通過下調(diào)p-AKT蛋白的表達(dá)從而抑制了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，導(dǎo)致食管鱗狀細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力降低； N-Shh上調(diào)Gli1和Gli2之后， p-AKT呈現(xiàn)高表達(dá)，從而促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，增加了細(xì)胞的侵襲能力；用GANT6