AGEs通過PI3K-AKT GSK-3β信號通路促進人主動脈血管平滑肌細胞鈣化.pdf

1、目的：探究晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced Glycation End Products,AGEs）對人主動脈血管平滑肌細胞(Human Aorta Vascular Smooth Muscle Cells,HASMCs)鈣化的影響，本實驗主要通過體外實驗方法驗證 AGEs對于HASMCs鈣化的影響，進一步探究其是否是通過PI3K/AKT GSK-3β信號通路激活wnt/β-catenin信號通路從而促進HASMCs的鈣化。為血管鈣

2、化的預(yù)防和治療提供新的策略。
　　方法：培養(yǎng)原代人主動脈血管平滑肌細胞，動態(tài)觀察細胞形態(tài)并應(yīng)用免疫熒光方法進行細胞鑒定；用不同濃度AGEs-BSA（0ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml）干預(yù)5天后提取細胞總蛋白，western blot方法檢測鈣化相關(guān)蛋白 OPG、BMP的表達量。馮庫薩染色、茜素紅染色檢測各組鈣化情況。應(yīng)用 AKT特異性抑制劑 LY29400220mmo

3、l/L和 GSK-3β特異性抑制劑 TWS11910mmol/L處理HASMCs后加入40ug/ml的AGEs處理15min后提取細胞總蛋白，western blot方法檢測P-AKT、AKT、P-GSK-3β、GSK-3β等蛋白的表達量。為了進一步驗證PI3K/AKT信號通路及GSK-3β信號通路對于HASMCs鈣化的影響，我們應(yīng)用LY29400220mmol/L預(yù)處理HASMCs2小時，TWS11910mmol/L預(yù)處理HASMCs

4、12小時后加入40ug/mlAGEs繼續(xù)干預(yù)5天，提取細胞總蛋白，檢測鈣化相關(guān)蛋白OPG、BMP、β-catenin的表達量。為了進一步探究PI3K/AKT信號通路在AGEs引起的HASMCs鈣化中的作用，我們應(yīng)用AKT-siRNA轉(zhuǎn)染HASMCs建立AKT基因沉默細胞模型，同時選用GSK-3β-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染HASMCs建立GSK-3β基因沉默細胞模型，western blot檢測AKT、GSK-3蛋白以驗證轉(zhuǎn)染是否成功及轉(zhuǎn)染效率

5、。待建立穩(wěn)定的低表達AKT、GSK-3細胞模型后用40ug/ml的AGEs干預(yù)5天后提取細胞總蛋白，檢測鈣化相關(guān)蛋白的表達。
　　結(jié)果：1、AGEs能促進 HASMCs的鈣化，且呈濃度依賴性，相比于對照組，AGEs組鈣化相關(guān)蛋白的表達量明顯升高（P<0.05），且在AGEs濃度為40ug/ml時作用最為明顯；馮庫薩染色和茜素紅染色結(jié)果提示：AGEs+鈣化培養(yǎng)組的鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯高于單純鈣化培養(yǎng)組；2、AGEs能促進HASMCs A

6、KT、GSK-3β蛋白的磷酸化，相比于對照組，AGEs組P-AKT和P-GSK-3β蛋白的表達量明顯升高（p<0.05）,且呈時間和濃度依賴性，在AGEs濃度為為25ug/ml，干預(yù)15min時，其磷酸化水平最高，這也將作為我們下一步實驗最佳干預(yù)濃度和時間,但是AKT、GSK-3β的表達量無明顯變化（p>0.05）；3、AGEs+LY294002組P-AKT及P-GSK-3β蛋白的表達量相比于AGEs組明顯下降（p<0.05），但總的A

7、KT及GSK-3β的表達量無明顯變化（p>0.05）；AGEs+LY294002組鈣化相關(guān)蛋白的表達量相較于 AGEs組明顯下降（p<0.05)；4、在應(yīng)用AKT-siRNA轉(zhuǎn)染HASMCs后，si-RNA轉(zhuǎn)染組AKT蛋白的表達量與對照組相比明顯降低（p<0.05），而在加入AGEs干預(yù)后， AKT-siRNA轉(zhuǎn)染組鈣化相關(guān)蛋白OPG、BMP的表達量明顯低于單純AGEs干預(yù)組（p<0.05）；5、HASMCs轉(zhuǎn)染GSK-3β-RNAi慢

8、病毒3天后用熒光顯微鏡能觀察到細胞內(nèi)穩(wěn)定表達的綠色熒光，western blot檢測GSK-3β蛋白表達量，與對照組相比，GSK-3β-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染組GSK-3β蛋白表達量明顯降低（p<0.01）,在用 AGEs干預(yù)后，相比于單純 AGEs干預(yù)組， GSK-3β-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染組鈣化相關(guān)蛋白的表達量明顯增加(p<0.05)。
　　結(jié)論：1、AGEs能促進HASMCs的鈣化；2、AGEs能激活PIK3/AKT信號通路，而活