PI3K-Akt信號途徑抑制缺血缺氧心肌細胞凋亡及其機制研究.pdf

1、嚴重燒傷后，心肌局部血流量迅速減少，發(fā)生缺血缺氧損害和心功能減退，不僅引起心功能不全，還可誘發(fā)或加重休克，成為燒傷早期缺血缺氧的重要啟動因素之一。根據(jù)上述認識，提出了燒傷后早期缺血缺氧損害的“休克心”假說。 PI3K是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。P13K激活后在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，進一步引起信號蛋白Akt活化?；罨腁kt通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-kB、GSK-3、FKHR、D21

2、Cip1和p27Kip1等，進而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等。 P13K/Akt信號途徑在燒傷早期心肌細胞的表達、作用及調(diào)控機制尚不明確。我們假設(shè)：在燒傷早期心肌細胞遭受缺血缺氧損傷的同時，P13K/Akt信號途徑即被激活，并可能通過調(diào)控鈣濃度、線粒體膜穩(wěn)定性以及凋亡基因表達發(fā)揮抗凋亡作用，P13K/Akt/HIF-1α則可能是這種抗凋亡作用的重要分子機制。本實驗對這一假設(shè)進行了驗證。 材料方法： 采用動

3、物實驗和體外實驗相結(jié)合的方法。 1.建立燙傷大鼠模型，應(yīng)用RT-PCR檢測心肌組織P13KmRNA表達變化，Westernblot檢測心肌組織P13K及磷酸化Akt蛋白表達。 2.建立體外培養(yǎng)的大鼠心肌細胞缺血缺氧模型，應(yīng)用P13K/Akt通路特異性抑制劑LY294002及激動劑IGF-1，并結(jié)合ELISA、激光共聚焦、TUNEL等方法等方法觀察缺血缺氧條件下該信號通路對心肌細胞活力、LDH酶活性、線粒體膜電位、胞內(nèi)鈣濃

4、度及凋亡率等指標的影響，明確P13K/Akt信號途徑在缺血缺氧心肌細胞中的作用。 3.建立體外培養(yǎng)的大鼠心肌細胞缺血缺氧模型，應(yīng)用RT-PCR觀察PI3K/Akt對P53、C-myc、Bax、Bcl-2等凋亡相關(guān)基因以及HIF-1amRNA的影響，并應(yīng)用LY294002和Rapamycin，結(jié)合Westernblot探討可能存在的凋亡調(diào)控機制。 主要結(jié)果與結(jié)論： 1.嚴重燒傷早期即有P13KmRNA及蛋白的高表達

5、，并伴有Akt磷酸化水平的顯著增加，說明燒傷早期P13K/Akt途徑即被激活。 2.缺血缺氧條件下，心肌細胞活力持續(xù)下降，P13K/Akt抑制劑LY294002抑制P13K/Akt激活后，心肌細胞活力下降更為明顯。表明該途徑可能具有維持細胞活性，拮抗缺血缺氧損害的作用。 3.缺血缺氧刺激導(dǎo)致心肌細胞細胞膜結(jié)構(gòu)破壞，LDH漏出增加；LY294002抑制P13K/Akt激活后，缺血缺氧心肌細胞培養(yǎng)上清中LDH活性較單純?nèi)毖踅M

6、明顯升高。表明P13K/Akt能夠維持質(zhì)膜穩(wěn)定性，防止因膜結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致細胞死亡。 4.心肌細胞在缺血缺氧刺激下，細胞凋亡量明顯增加。LY294002抑制P13K/Akt激活后，缺血缺氧心肌細胞凋亡加??；予以IGF-1激活：P13K/Akt，缺血缺氧心肌細胞凋亡量明顯減少。說明P13K/Akt的激活能夠拮抗缺血缺氧心肌細胞凋亡，是細胞的內(nèi)源性保護反應(yīng)。 5.缺血缺氧6h后，心肌細胞胞內(nèi)鈣濃度明顯升高，LY294002抑制

7、P13K/Akt激活后，缺血缺氧心肌細胞胞內(nèi)鈣濃度升高更為顯著；予以IGF-1激活P13K/Akt，缺血缺氧心肌細胞胞漿鈣離子濃度較單純?nèi)毖毖踅M明顯下降。說明PI3K/Akt的激活能夠減輕胞內(nèi)鈣超載，避免鈣超載引起的后續(xù)凋亡反應(yīng)。 6.缺血缺氧刺激6h、12h后，線粒體膜電位明顯下降，提示線粒體膜通透性增加；LY294002抑制P13K/Akt激活后，缺血缺氧心肌細胞線粒體膜電位下降更為顯著；予以IGF-1激活P13K/Akt

8、，缺血缺氧心肌細胞線粒體膜電位下降幅度明顯減小，表明P13K/Akt能夠維持線粒體膜穩(wěn)定性，防止因線粒體MPTP的開放而導(dǎo)致后續(xù)凋亡反應(yīng)的啟動。 7.缺血缺氧心肌細胞P13K/Akt信號途徑的活化可以上調(diào)HIF-1αmRNA轉(zhuǎn)錄活性，同時P13K/Akt及mTOR蛋白磷酸化均可以在蛋白水平上調(diào)HIF-1α的表達，以發(fā)揮HIF-1α的抗凋亡作用，拮抗心肌細胞的缺血缺氧損害。 8.缺血缺氧條件下，心肌細胞PI3K/Akt的活