木犀草素通過PI3K-Akt途徑調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化抑制凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的:動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)發(fā)病率和死亡率居各種疾病前列，嚴(yán)重地威脅著人類的健康和生命，探討其發(fā)病機(jī)制對(duì)于AS的防治具有重要的臨床意義和必要性。巨噬細(xì)胞作為形成AS中的重要因素，是目前預(yù)防和治療AS的重要靶點(diǎn)。探究有效的方法使得具有促炎作用的M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有抗炎作用的M2型巨噬細(xì)胞，成為了預(yù)防和治療AS的重要研究方向。木犀草素(Luteolin，Lut)可通過PI3K/Akt通道發(fā)揮心肌保護(hù)作用，近

2、期研究發(fā)現(xiàn)Lut具有很強(qiáng)的抗AS作用。因此，本研究以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，通過血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，以PI3K/Akt通路抑制劑LY294002為對(duì)照，探討Lut對(duì)巨噬細(xì)胞表型的影響及其對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的作用，觀察Lut對(duì)PI3K/Akt通道的作用及其與巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、凋亡之間的關(guān)系，為Lut預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化性疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:研究對(duì)象為健康雌性成年C57

3、BL/6J小鼠，體重20-25g，8周齡，清潔級(jí)。1.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞原代細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定:對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及CD68免疫熒光鑒定巨噬細(xì)胞表面特征性標(biāo)征判斷巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)情況。選用濃度分別為6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM的Lut作用于巨噬細(xì)胞，通過CCK8法和乳酸脫氫酶檢測(lactate dehydrogenase LDH)明確Lut對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活力和

4、毒性的影響，觀察Lut的最佳作用濃度。2.觀察Lut對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡及表型轉(zhuǎn)化的影響:實(shí)驗(yàn)分組包括空白對(duì)照組、AngⅡ組(AngⅡ1μM預(yù)處理12小時(shí))、AngⅡ+Lut組(Lut預(yù)處理12小時(shí)后AngⅡμM12小時(shí))、AngⅡ+LY(LY294002)組(LY50μM預(yù)處理1小時(shí)后AngⅡ1μ M12小時(shí))、AngⅡ+Lut+LY組(LY預(yù)處理1小時(shí)、Lut預(yù)處理12小時(shí)后AngⅡ1μM12小時(shí))。觀察指標(biāo)包括:(1)巨噬

5、細(xì)胞凋亡情況:采用Annexin V/PI檢測細(xì)胞凋亡比率，Western blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3。(2)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化情況:采用流式細(xì)胞儀和ELISA法檢測巨噬細(xì)胞表型分子標(biāo)記物。3.Lut對(duì)Akt蛋白的作用特點(diǎn)(包括劑量及時(shí)間特點(diǎn)):實(shí)驗(yàn)分組包括空白對(duì)照組、AngⅡ組(AngⅡ1μ M預(yù)處理12小時(shí))、AngⅡ+LY(LY294002)組(LY50μM

6、預(yù)處理1小時(shí)后AngⅡ1μ M12小時(shí))、AngⅡ+Lut不同時(shí)間干預(yù)組(以Lut25μM預(yù)處理3小時(shí)、9小時(shí)、12小時(shí)后AngⅡ1μM12小時(shí))、AngⅡ+Lut不同劑量干預(yù)組(Lut6.25μM、12.5μM、25μM預(yù)處理12小時(shí)后AngⅡ1μM12小時(shí))，利用Western blot檢測Akt、 p-Akt308、p-Akt473蛋白表達(dá)水平。采用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤

7、表示(mean±S.E.M.)，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析或兩因素方差分析(one-way ANOVA or two-way ANOVA)，按α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)結(jié)果:倒置顯微鏡下可見原代培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞生長良好，激光共聚焦顯微鏡觀察可見成熟的巨噬細(xì)胞表面活性標(biāo)記物CD68的陽性率大于99％，提示巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)成功，可用于實(shí)驗(yàn)。2.CCK-8法

8、及LDH檢測不同藥物濃度Lut的毒性試驗(yàn):與對(duì)照組(Lut0μM)相比，從6.25μM到25μM濃度的Lut作用12h對(duì)細(xì)胞活力均無明顯影響，而從50μM濃度Lut處理組細(xì)胞活力明顯下降(P＜0.001);與對(duì)照組比較，Lut50μM濃度組LDH含量明顯增加(P＜0.05)。故選用25μM濃度的Lut對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。3.巨噬細(xì)胞凋亡情況: Annexin V/PI檢測提示與AngⅡ組相比，Lut預(yù)處理組及LY預(yù)處理組均減少AngⅡ刺

9、激引起的巨噬細(xì)胞凋亡比率(P＜0.001)，且Lut組效果顯著強(qiáng)于LY組(P＜0.01);但與Lut組比較，Lut+LY組的效果未見增強(qiáng)(P＞0.05)。Westernbolt檢測提示與AngⅡ組相比，Lut預(yù)處理組及LY預(yù)處理組Bcl-2和caspase-3蛋白水平顯著上調(diào)(P＜0.001)，Bax和cleaved caspase-3蛋白水平顯著下調(diào)(P＜0.001)，且Lut組效果顯著強(qiáng)于LY組(P＜0.01);但與Lut組比較，L

10、ut+LY組的效果未見增強(qiáng)(P＞0.05)。4.巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化情況:ELISA檢測提示與AngⅡ組相比，Lut預(yù)處理組及LY預(yù)處理組M1巨噬細(xì)胞分子標(biāo)志(IL-6，TNF-α，iNOS，CD16/32)表達(dá)顯著減少(P＜0.001)，M2巨噬細(xì)胞分子標(biāo)志(Dectin-1，IL-10，Arg-1，CD206)表達(dá)顯著增加(P＜0.001)，且Lut組效果顯著強(qiáng)于LY組(P＜0.01);但與Lut組比較，Lut+LY組的效果未見增強(qiáng)(P

11、＞0.05)。流式細(xì)胞儀檢測提示與AngⅡ組相比，Lut預(yù)處理組及LY預(yù)處理組M1型巨噬細(xì)胞(CD16/32細(xì)胞)顯著減少(P＜0.001)，M2型巨噬細(xì)胞(CD206細(xì)胞)顯著增多(P＜0.001)，且Lut組效果顯著強(qiáng)于LY組(P＜0.01);但與Lut組比較，Lut+LY組的效果未見增強(qiáng)(P＞0.05)。5.Lut對(duì)Akt蛋白的作用特點(diǎn):Western Blot檢測提示，與AngⅡ組相比，LY組顯著抑制p-Akt(308)和p-A

12、kt(473)表達(dá)(P＜0.001)。Lut25μM預(yù)處理3小時(shí)組、9小時(shí)組、12小時(shí)組對(duì)p-Akt(308)和p-Akt(473)水平的抑制較AngⅡ組、LY組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且抑制效應(yīng)隨著時(shí)間延長逐漸增強(qiáng)，不同時(shí)間組對(duì)p-Akt(473)水平的抑制均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但Lut3小時(shí)組、9小時(shí)組對(duì)p-Akt(308)的抑制無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，Lut12小時(shí)組對(duì)p-Akt(308)的抑制顯著強(qiáng)于3小

13、時(shí)組、9小時(shí)組(P＜0.05)。Lut6.25μ M、12.5μM、25μ M預(yù)處理組對(duì)p-Akt(308)和p-Akt(473)水平的抑制較AngⅡ組、LY組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且抑制效應(yīng)隨著劑量增加逐漸增強(qiáng)，不同劑量組對(duì)p-Akt(473)水平的抑制均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但Lut6.25μ M、12.5μ M組對(duì)p-Akt(308)的抑制無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，Lut25μ M組對(duì)p-Akt(308)的抑