c-MET對(duì)人食管鱗癌Eca109細(xì)胞放射敏感性影響的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景與目的:食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，全世界每年新發(fā)病例在增加，其中，半數(shù)以上食管癌發(fā)生在中國(guó)。據(jù)《2015中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)》報(bào)道，我國(guó)食管癌發(fā)病率已躍居全國(guó)惡性腫瘤發(fā)病的第3位，死亡居第4位。手術(shù)、放療以及化療等相結(jié)合的多學(xué)科綜合治療是食管癌的主要治療模式。雖然近年來各種治療手段都有了很大程度的發(fā)展，但食管癌總體預(yù)后仍較差，5年生存率僅15％～25％。另外，患者預(yù)后個(gè)體差異也較大，這很大程度上取決于食管癌的生物學(xué)行為，尤其是

2、不同基因特征對(duì)腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及治療療效產(chǎn)生至關(guān)重要的影響。目前食管癌的特異性分子標(biāo)志物并不明確。MET(Mesenchymal-epithelialTransition Factor)是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)的細(xì)胞表面受體，也被叫做c-Met或HGFR(Hepatocyte Growth Factor Receptor)，屬于酪氨酸激酶受體(Receptor Tyrosine K

3、inase，RTK)家族成員，由c-Met基因編碼。異常的RTK信號(hào)途徑在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移以及耐藥的過程中具有重要作用，而c-Met信號(hào)通路正屬于RTK信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)c-Met信號(hào)通路的激活與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及放化療耐受密切相關(guān)，如結(jié)腸癌、胃癌、卵巢癌、頭頸部鱗癌、肺癌、乳頭狀腎癌、三陰性乳腺癌、前列腺癌等。在食管腺癌中，c-Met的表達(dá)率為34％～54％，且與預(yù)后明顯相關(guān)。而在亞裔食管鱗癌中，其同樣存在著較高

4、的表達(dá)率，約34％～69％。因此，c-Met可能成為食管鱗癌治療新的靶點(diǎn)。另一方面，放射治療是食管癌的重要治療手段，雖然近年來放療設(shè)備和放療技術(shù)有了很大的改進(jìn)，但放療抵抗依然是影響食管鱗癌放療療效的一個(gè)重要原因。放療抵抗的產(chǎn)生是一個(gè)多基因、多因子、多機(jī)制共同作用的復(fù)雜過程，與細(xì)胞周期阻滯、相關(guān)基因改變、腫瘤微環(huán)境變化、自噬性調(diào)節(jié)及腫瘤干細(xì)胞的存在等多種因素相關(guān)。一些臨床研究顯示c-Met的表達(dá)水平與放療療效存在相關(guān)性?；A(chǔ)研究表明腫瘤細(xì)

5、胞和/或間質(zhì)細(xì)胞受到電離輻射后，能夠激活c-Met傳導(dǎo)通路，進(jìn)而引起腫瘤細(xì)胞的放射抵抗。因此，抑制c-Met信號(hào)通路有可能減少放療抵抗，從而提高放療療效。綜上所述，研究c-Met與食管鱗癌放射敏感性的相關(guān)性具有理論基礎(chǔ)和積極的臨床意義。我們的前期研究已提示c-Met蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)存在差異，且與患者的預(yù)后顯著相關(guān)(p=0.001)。亞組分析還提示，在接受術(shù)后輔助放療的患者中，c-Met高表達(dá)者預(yù)后顯著差于低表達(dá)者（p=0.002）

6、。在隨后的研究中，我們對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究，期望為臨床食管鱗癌新的靶向治療藥物的應(yīng)用及精準(zhǔn)的多學(xué)科綜合治療的開展提供新思路。
　　材料與方法:在前期研究中，選取在本院行食管癌手術(shù)的180例食管鱗癌患者術(shù)后腫瘤組織石蠟塊進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，分析c-Met蛋白表達(dá)與患者腫瘤病理特點(diǎn)及預(yù)后的相關(guān)性，并分析其對(duì)術(shù)后輔助放療療效的影響。在隨后的研究中，首先選用c-Met抑制劑BPI-9016M進(jìn)行干預(yù)，探討HGF/c-Met信號(hào)通路抑制對(duì)人食

7、管鱗癌Eca109細(xì)胞株生物學(xué)行為及放射敏感性的影響;然后，將Eca109細(xì)胞分對(duì)照組、BPI-9016M組、輻射組和輻射+BPI-9016M組共4組，采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)c-Met抑制劑BPI-9016M對(duì)Eca109細(xì)胞細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，并用蛋白免疫印跡法(Western Blot，WB)檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白含量的改變，進(jìn)一步探討其具體的分子作用機(jī)制;最后，建立人食管鱗癌裸鼠移植瘤模型，將荷瘤裸鼠分

8、對(duì)照組、BPI-9016M組、輻射組和輻射+BPI-9016M組共4組，通過腫瘤體積計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)延緩情況、利用增長(zhǎng)系數(shù)(Enhancement Factor，EF)評(píng)價(jià)c-Met抑制劑BPI-9016M的放射增敏效果。
　　結(jié)果:1.在前期針對(duì)臨床病例的免疫組化分析中，我們發(fā)現(xiàn)c-Met蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)存在差異，且與患者預(yù)后顯著相關(guān)，高表達(dá)者預(yù)后差（p=0.001）。亞組分析提示，接受術(shù)后輔助放療的患者，c-Met高表達(dá)者預(yù)

9、后顯著差于低/陰性表達(dá)者（p=0.002）。2.體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，c-Met抑制劑BPI-9016M明顯抑制Eca109人食管鱗癌細(xì)胞株的體外增殖生長(zhǎng)，存在量-效關(guān)系;Eca109細(xì)胞的生長(zhǎng)受放射線的影響，放射劑量越大，Eca109細(xì)胞生長(zhǎng)越受限制，并且c-Met抑制劑BPI-9016M對(duì)Eca109細(xì)胞有放射增敏作用，用多靶單擊模型計(jì)算的放射增敏比為1.40。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，c-Met抑制劑BPI-9016M聯(lián)合輻射對(duì)Eca

10、109細(xì)胞的細(xì)胞周期影響不大，但顯著增加其細(xì)胞凋亡率（p＜0.05）;蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與單純輻射組相比較，Eca109細(xì)胞經(jīng)BPI-9016M處理后再聯(lián)合輻射，使凋亡相關(guān)的蛋白P53和Bcl-2下調(diào)、活化的Caspase3和Caspase9上調(diào)。進(jìn)一步的DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果還提示:Eca109細(xì)胞經(jīng)放射線照射后，引起了ATM、ATR、Chk1、Chk2和H2AX的顯著磷酸化，然而各蛋白的磷酸化水平在經(jīng)BPI-901

11、6M預(yù)處理后均有所下降，以γ H2AX下降得最為明顯。3.體內(nèi)動(dòng)物模型研究顯示，Eca109細(xì)胞皮下接種于裸鼠成瘤后，分別經(jīng)對(duì)照組、BPI-9016M組、輻射組以及輻射+BPI-9016M組的不同處理，從腫瘤生長(zhǎng)曲線來看，相較于空白對(duì)照組，BPI-9016M組、輻射組以及輻射+BPI-9016M組腫瘤的生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制，其中輻射+BPI-9016M組較其他治療組均更明顯（p＜0.05），聯(lián)合組c-Met抑制劑BPI-9016M的

12、放射增敏系數(shù)(EF)為1.51。
　　討論:已有文獻(xiàn)報(bào)道，食管癌c-Met蛋白的過表達(dá)與腫瘤惡性生物學(xué)行為相關(guān)。在西方國(guó)家的研究中發(fā)現(xiàn)食管腺癌c-Met蛋白的過表達(dá)與患者的預(yù)后生存相關(guān)，而在食管鱗癌患者中，其與預(yù)后的相關(guān)性尚不清楚。我們的前期研究顯示，食管鱗癌患者c-Met蛋白的高表達(dá)與其預(yù)后差顯著相關(guān)，與國(guó)內(nèi)一些針對(duì)食管鱗癌的免疫組化研究結(jié)果報(bào)道相一致，提示c-Met基因有可能是食管鱗癌藥物治療的潛在靶點(diǎn)。我們前期的免疫組化亞組

13、分析還提示，接受術(shù)后輔助放療的患者，c-Met高表達(dá)者預(yù)后顯著差于低表達(dá)者，分析原因，與c-Met可能參與多種放療抵抗的機(jī)制相關(guān)。我們的體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，放射線抑制人食管鱗癌Eca109細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，而c-Met抑制劑BPI-9016M增加了Eca109細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，c-Met抑制劑BPI-9016M聯(lián)合輻射對(duì)Eca109細(xì)胞的細(xì)胞周期影響不大，但顯著增加其細(xì)胞凋亡率。蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn)提示c-Met抑

14、制劑BPI-9016M預(yù)處理Eca109細(xì)胞后可增加放射后促細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的含量。在我們的研究中，BPI-9016M聯(lián)合輻射組活化的Caspase3和Caspase9蛋白較其他組別顯著增加，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase家族成員大多數(shù)是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)子或效應(yīng)子，Caspase9為凋亡啟動(dòng)子，Caspase3為凋亡效應(yīng)子，在細(xì)胞凋亡過程中均發(fā)揮重要作用，尤其是Caspase3在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用，一旦被激活，即發(fā)生下游的級(jí)聯(lián)

15、反應(yīng)，使凋亡不可避免。在我們的研究中，BPI-9016M組Eca109細(xì)胞中的P53蛋白稍有減少，輻射組其表達(dá)量與對(duì)照組接近，而在輻射+BPI-9016M組P53顯著減少，認(rèn)為BPI-9016M聯(lián)合放射線可通過減少P53的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞凋亡;在BPI-9016M聯(lián)合輻射組，功能與P53相似的抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2也明顯減少。進(jìn)一步的研究顯示， Eca109細(xì)胞經(jīng)輻射處理后，與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白ATM、ATR、Chk1、Chk2和

16、H2AX的磷酸化水平顯著增加，而細(xì)胞預(yù)先經(jīng)c-Met抑制劑BPI-9016M處理，再予以輻射，這些DNA損傷相關(guān)的關(guān)鍵蛋白的磷酸化被不同程度抑制。從機(jī)制上解讀，輻射可通過誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，放射抵抗的主要原因是由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性或者獲得性的輻射抵抗，主要表現(xiàn)在DNA損傷修復(fù)能力的增強(qiáng)。DNA損傷發(fā)生后，細(xì)胞可激活相應(yīng)的修復(fù)通路對(duì)其進(jìn)行修復(fù)，其反應(yīng)通路主要由感受因子、傳導(dǎo)通路及效應(yīng)因子組成。DNA損傷發(fā)生后，感受因子RAD

17、9-HUS1-RAD1復(fù)合體可通過一個(gè)包含有RAD17的蛋白復(fù)合體募集至DNA損傷位點(diǎn)，以促進(jìn)ATR-介導(dǎo)的效應(yīng)蛋白激酶Chk1的磷酸化及激活，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期S期的進(jìn)展及G2/M期的阻滯。另一個(gè)感受因子MRE11-RAD50-NBS1(MRN)復(fù)合體，可通過檢測(cè)雙鏈斷裂位點(diǎn)，在DNA雙鏈斷裂區(qū)域周圍募集ATM并促進(jìn)ATM介導(dǎo)的組蛋白H2AX磷酸化，隨后一系列的修復(fù)相關(guān)因子及蛋白招募至DNA損傷區(qū)域，形成損傷點(diǎn)，參與DNA的損傷修復(fù)進(jìn)程

18、。從我們的研究可以推測(cè)c-Met抑制劑增加食管鱗癌放射敏感性的機(jī)制可能部分是通過抑制ATR-Chk1、ATM-Chk2傳導(dǎo)通路的活化從而抑制細(xì)胞DNA損傷修復(fù)促進(jìn)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。我們的研究表明c-Met可能是食管鱗癌放療增敏的重要靶點(diǎn)之一，靶向抑制c-Met聯(lián)合放療在提高臨床食管鱗癌放療療效中具有重要的研究意義。
　　結(jié)論:我們的研究探討了c-Met抑制劑BPI-9016M聯(lián)合放射線對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Eca109細(xì)胞生物學(xué)特性