食管鱗癌放射敏感性相關(guān)miRNA的篩選及驗(yàn)證.pdf

1、研究背景與目的:食管癌的治療主要是手術(shù)治療、放療、化療，但由于其早期癥狀隱匿，就診時(shí)絕大部分的食管癌患者已屬于中晚期失去了手術(shù)時(shí)機(jī)，故放射治療成為了食管癌主要及其有效治療手段之一。不同食管癌個(gè)體之間其放療敏感性存在差異，由此導(dǎo)致了放療療效的差異，因此預(yù)測(cè)食管癌放射敏感性具有重要的意義。研究顯示不同放射敏感性的食管癌細(xì)胞具有差異的miRNA表達(dá)譜，那不同放射敏感性食管癌組織是否也具有差異表達(dá)的miRNA，機(jī)制又如何。有研究顯示Bmi-1高

2、表達(dá)與食管癌放射抵抗密切相關(guān)，生物信息軟件分析示Bmi-1是miR-203的靶基因之一。本實(shí)驗(yàn)旨在研究不同放射敏感性的食管鱗癌病人miRNA的表達(dá)差異及miR-203是否能通過下調(diào)Bmi-1的表達(dá)來增加食管鱗癌TE-1細(xì)胞的放射敏感性。
　　方法:
　　1.根據(jù)RECIST指南（1.1版本）標(biāo)準(zhǔn)將6例通過同步放化療的食管鱗癌病人分為敏感組和不敏感組，收集治療前組織標(biāo)本并進(jìn)行配對(duì)。應(yīng)用miRNA芯片檢測(cè)兩組標(biāo)本miRNA的表達(dá)

3、差異，預(yù)測(cè)其可能的靶基因，選取其中的miR-374c-5p進(jìn)行食管癌細(xì)胞株TE-1的轉(zhuǎn)染，qPCR檢測(cè)其預(yù)測(cè)的靶基因CD47，CYFIP2的表達(dá)情況。
　　2.結(jié)合文獻(xiàn)及芯片結(jié)果選取miR-203和其靶基因Bmi-1為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-203模擬物(miR-203mimic)及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染序列(miR-203 NC)進(jìn)入食管鱗癌TE-1細(xì)胞中，miRNA-203 mim

4、ics和miRNA-203 NC濃度均為50 nmol/L，實(shí)驗(yàn)共設(shè)3組，即miRNA-203 mimic轉(zhuǎn)染組、miR-203 NC轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組。Westernblot檢測(cè)Bmi-1蛋白的表達(dá)情況，單克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TE-1細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)果:
　　1.與放射不敏感組比較，放射敏感組中有2個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)超過1.5倍，為miR-1272，miR-5571-5p;有8個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)超過1.5倍，為miR-

5、125b-1-3p,miR-5002-3p,miR-374c-5p,miR-3680-5p,miR-3908,miR-4292，miR-1915-3p，miR-4516。研究顯示其中miR-125b-1-3p與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展及其放化療敏感性密切相關(guān)。
　　2.miR-374c-5p預(yù)測(cè)的靶基因?yàn)镃YFIP2，DDIT4，CD47，PTTG1，TNFRSF25，cyclinE2等，這些靶基因與腫瘤凋亡、發(fā)生、發(fā)展及其預(yù)后密切相關(guān)

6、。
　　3.qPCR結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組CD47和CYFIP2的表達(dá)未見明顯降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.1)。
　　4.Western blot結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照及空白對(duì)照組分別比較，轉(zhuǎn)染組中Bmi-1明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);陰性對(duì)照組與空白組比較，Bmi-1有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.01)。
　　5.克隆形成實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)miR-203可增加食管癌細(xì)胞TE-1放

7、射敏感性。轉(zhuǎn)染組，陰性對(duì)照組，空白組的D0依次為1.498、1.6295、1.7，Dq依次為1.3335、1.8578、1.9715，、SF2依次為0.6065、0.73668、0.74595，α/B依次為3.8165、1.0270、1.1409。轉(zhuǎn)染組中D0、Dq、SF2均有所降低，α/β有所升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.本研究篩選出的10個(gè)差異表達(dá)的miRNA可能和食管鱗癌放射敏感性相關(guān)，其中miR-