食管鱗癌放射敏感性相關(guān)miRNA的篩選及驗證.pdf

1、研究背景與目的:食管癌的治療主要是手術(shù)治療、放療、化療，但由于其早期癥狀隱匿，就診時絕大部分的食管癌患者已屬于中晚期失去了手術(shù)時機，故放射治療成為了食管癌主要及其有效治療手段之一。不同食管癌個體之間其放療敏感性存在差異，由此導(dǎo)致了放療療效的差異，因此預(yù)測食管癌放射敏感性具有重要的意義。研究顯示不同放射敏感性的食管癌細胞具有差異的miRNA表達譜，那不同放射敏感性食管癌組織是否也具有差異表達的miRNA，機制又如何。有研究顯示Bmi-1高

2、表達與食管癌放射抵抗密切相關(guān)，生物信息軟件分析示Bmi-1是miR-203的靶基因之一。本實驗旨在研究不同放射敏感性的食管鱗癌病人miRNA的表達差異及miR-203是否能通過下調(diào)Bmi-1的表達來增加食管鱗癌TE-1細胞的放射敏感性。
　　方法:
　　1.根據(jù)RECIST指南（1.1版本）標準將6例通過同步放化療的食管鱗癌病人分為敏感組和不敏感組，收集治療前組織標本并進行配對。應(yīng)用miRNA芯片檢測兩組標本miRNA的表達

3、差異，預(yù)測其可能的靶基因，選取其中的miR-374c-5p進行食管癌細胞株TE-1的轉(zhuǎn)染，qPCR檢測其預(yù)測的靶基因CD47，CYFIP2的表達情況。
　　2.結(jié)合文獻及芯片結(jié)果選取miR-203和其靶基因Bmi-1為進一步實驗對象，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染miR-203模擬物(miR-203mimic)及陰性對照轉(zhuǎn)染序列(miR-203 NC)進入食管鱗癌TE-1細胞中，miRNA-203 mim

4、ics和miRNA-203 NC濃度均為50 nmol/L，實驗共設(shè)3組，即miRNA-203 mimic轉(zhuǎn)染組、miR-203 NC轉(zhuǎn)染組、空白對照組。Westernblot檢測Bmi-1蛋白的表達情況，單克隆實驗檢測TE-1細胞的增殖情況。
　　結(jié)果:
　　1.與放射不敏感組比較，放射敏感組中有2個miRNA表達上調(diào)超過1.5倍，為miR-1272，miR-5571-5p;有8個miRNA表達下調(diào)超過1.5倍，為miR-

5、125b-1-3p,miR-5002-3p,miR-374c-5p,miR-3680-5p,miR-3908,miR-4292，miR-1915-3p，miR-4516。研究顯示其中miR-125b-1-3p與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展及其放化療敏感性密切相關(guān)。
　　2.miR-374c-5p預(yù)測的靶基因為CYFIP2，DDIT4，CD47，PTTG1，TNFRSF25，cyclinE2等，這些靶基因與腫瘤凋亡、發(fā)生、發(fā)展及其預(yù)后密切相關(guān)

6、。
　　3.qPCR結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組CD47和CYFIP2的表達未見明顯降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.1)。
　　4.Western blot結(jié)果顯示，與陰性對照及空白對照組分別比較，轉(zhuǎn)染組中Bmi-1明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001);陰性對照組與空白組比較，Bmi-1有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.01)。
　　5.克隆形成實驗表明過表達miR-203可增加食管癌細胞TE-1放

7、射敏感性。轉(zhuǎn)染組，陰性對照組，空白組的D0依次為1.498、1.6295、1.7，Dq依次為1.3335、1.8578、1.9715，、SF2依次為0.6065、0.73668、0.74595，α/B依次為3.8165、1.0270、1.1409。轉(zhuǎn)染組中D0、Dq、SF2均有所降低，α/β有所升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.本研究篩選出的10個差異表達的miRNA可能和食管鱗癌放射敏感性相關(guān)，其中miR-