喜樹堿衍生物對Sf9細(xì)胞的生物活性及其與TopoⅠ分子對接研究.pdf

1、喜樹堿（以下簡稱 CPT）是從珙桐科植物喜樹（Camptotheca acuminata）分離的五環(huán)生物堿類化合物，不僅以顯著的抗腫瘤、抗病毒活性而在醫(yī)藥研究開發(fā)領(lǐng)域得到重視，而且因其突出的殺蟲活性受到農(nóng)藥創(chuàng)制領(lǐng)域關(guān)注。本文以喜樹堿D環(huán)的O原子S取代同時7-位修飾的27個結(jié)構(gòu)改造物為供試化合物，包括7-?；虼矘鋲A衍生物（CPTA-1～CPTA-12），硫代喜樹堿（CPTA-13）和7-?；矘鋲A衍生物（CPTA-14～CPTA-27

2、），通過 MTT法測定對草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda(J.E.Smmith)）離體培養(yǎng)細(xì)胞系Sf9的增殖抑制活性，通過流式細(xì)胞術(shù)研究化合物的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性，通過生理生化、分子生物學(xué)技術(shù)研究其潛在作用靶標(biāo)，運(yùn)用分子對接技術(shù)探討其作用機(jī)制。具體研究結(jié)果如下：
　　一、喜樹堿衍生物對Sf9細(xì)胞增殖抑制作用
　　通過MTT法測定結(jié)果表明，27個供試喜樹堿衍生物均對Sf9細(xì)胞有不同程度的細(xì)胞增殖抑制活性，抑

3、制效果隨時間和濃度增加而增加。硫代喜樹堿和大部分7-?；虼矘鋲A衍生物的細(xì)胞毒性較強(qiáng)，以10μg/mL處理24 h時，Sf9細(xì)胞增殖抑制率在50％～95%，其中CPTA-3,4,6,7,8,11,13,26在6 h、12h、24h、48 h的IC50低于喜樹堿的的IC50，表明這些衍生物的細(xì)胞增殖抑制活性比喜樹堿更強(qiáng)。
　　二、喜樹堿衍生物對Sf9細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用
　　四種7-?；虼矘鋲A衍生物（CPTA-1,3,9,1

4、1）分別處理Sf9細(xì)胞，通過倒置相差顯微鏡觀察到有大量的凋亡小體聚集在細(xì)胞周圍，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核偏移、細(xì)胞膜破損，細(xì)胞質(zhì)外流等凋亡現(xiàn)象。CPTA-1,3,9,11分別以2.5μg/mL處理Sf9細(xì)胞，提取細(xì)胞DNA通過凝膠電泳可見明顯的DNA ladder；通過Annexin V-FITC/PI雙染在熒光顯微鏡下可觀察到顯著的綠色和紅色的熒光以及Hoechst33342單染可觀察到強(qiáng)烈的藍(lán)色的熒光。這些結(jié)果表明CPTA-1,3,9,1

5、1能促使磷脂酰絲氨酸(PS)由膜內(nèi)向膜外翻，細(xì)胞核染色質(zhì)凝集，細(xì)胞膜通透性改變以及DNA片段化斷裂，誘導(dǎo)Sf9細(xì)胞凋亡。
　　通過流式細(xì)胞術(shù)分析喜樹堿及其衍生物處理后 Sf9細(xì)胞的凋亡率和周期變化。CPTA-1,3,9,11和CPT分別以2.5μg/mL處理后24 h，Sf9凋亡率分別對應(yīng)為25.1%、45.9%、19.9%、36.2%和23.3%，CPTA-3和CPTA-11的凋亡效果高于CPT，CPTA-1與CPT凋亡效果相當(dāng)

6、，而CPTA-9則更低，其結(jié)果與DNA片段化結(jié)果相一致。周期變化結(jié)果表明CPTA-1,3,9,11使Sf9細(xì)胞周期阻滯在S期。
　　熒光定量PCR測定結(jié)果表明，CPTA-1,3,9,11與CPT以1.0μg/mL分別處理Sf9細(xì)胞12 h時，Cyt C與Casepase9相對表達(dá)量顯著上升3～10倍，這預(yù)示CPTA-1,3,9,11誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能涉及線粒體通路。
　　三、喜樹堿衍生物抑制TopoⅠ活性分析
　　為了研

7、究供試喜樹堿衍生物是否是TopoⅠ的抑制劑，將27個喜樹堿衍生物分別處理從Sf9細(xì)胞中提取的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ，通過凝膠電泳觀察pBR322 DNA被TopoⅠ處理后的解旋程度可知，添加喜樹堿衍生物以1μmol/L處理37 min后的TopoⅠ能不同程度阻斷負(fù)超螺旋pBR322 DNA解旋，說明這27個喜樹堿衍生物均可以抑制TopoⅠ活性，阻礙DNA解旋。
　　四、草地貪夜蛾TopoⅠ編碼區(qū)的克隆和序列分析
　　草地貪夜蛾Topo

8、Ⅰ編碼區(qū)含有2790個堿基,編碼929個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為108.0KD，等電點(diǎn)為8.91。序列的分析結(jié)果顯示其無信號肽位點(diǎn)和無跨膜區(qū)域；大部分氨基酸表現(xiàn)出親水性；磷酸化位點(diǎn)總共有96個，其中Ser磷酸化位點(diǎn)有77個，Thr磷酸化位點(diǎn)有10個，Tyr磷酸化位點(diǎn)有9個。多重序列比對和進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，TopoⅠ基因的C端序列在不同的昆蟲中具有高度的保守性；草地貪夜蛾與鱗翅目昆蟲的甜菜夜蛾、金鳳蝶、柑橘鳳蝶、玉帶鳳蝶差異小，與膜翅目小

9、火蟻差異大。
　　五、喜樹堿衍生物與同源建模蛋白分子對接
　　通過Discover studio4.5軟件的模塊CDOCKER對供試喜樹堿衍生物與同源模建蛋白 TopoⅠ以及 DNA進(jìn)行半柔性對接，結(jié)果表明參與對接的TopoⅠ活性區(qū)域主要由 ARG530，ASP698，LYS697，THR887，ASN518，ARG654，HIS797、ILE700、ASN886等氨基酸組成，而DNA參與的殘基主要有DT10、DG11、C:

10、DC112、C:DA113、DT9、DT12等。它們與喜樹堿衍生物共同作用參與形成氫鍵、π-π堆積作用、π-Alkyl作用、π-Anion作用、π-Sigma、π-S鍵和范德華力等。7-?；虼矘鋲A衍生物D環(huán)中氧原子被硫原子取代，與殘基DT10或者C:DA113形成π-S鍵。結(jié)合細(xì)胞毒理實(shí)驗，表明在硫代喜樹堿的7-?；灰氲谋诫s環(huán)、苯環(huán)、丙基、甲氧苯基等供電子基團(tuán)，可以參與氫鍵的形成，或π-Sigma、π-Alkyl、范德華力作用的

11、形成，進(jìn)而增加復(fù)合物的穩(wěn)定性和細(xì)胞毒性。
　　基于以上結(jié)論，本文從27個喜樹堿衍生物中篩選獲得對細(xì)胞增殖有顯著抑制活性的化合物CPTA-3,4,6,7,8,11,13,26和能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的化合物CPTA-1,3,9,11，其中CPTA-3和CPTA-11細(xì)胞增殖抑制作用和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性顯著，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效果高于喜樹堿。本論文利用同源建模結(jié)合分子對接技術(shù)，探討供試喜樹堿衍生物作用機(jī)制，研究結(jié)果為后續(xù)研發(fā)以喜樹堿為先導(dǎo)化合物的