表達(dá)NDV HN和IBDV VP2融合蛋白重組減毒沙門菌的構(gòu)建及其特性研究.pdf

1、雞新城疫(Newcastle disease, ND)作為OIE A類疾病，雞傳染性法氏囊?。╥nfectious bursal disease, IBD）作為B類傳染病，給全球養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在我國，雞新城疫與傳染性法氏囊病一直是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要傳染病。雞新城疫傳染性強(qiáng)、死亡率高，且感染宿主范圍越來越廣。雞傳染性法氏囊病主要破壞雞的體液免疫中樞器官—法氏囊，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞功能受損，引起雞體的免疫抑制，從而影響新城疫、禽

2、流感等疫苗的免疫效果。當(dāng)前由于NDV及IBDV變異株、超強(qiáng)毒株和新毒株的流行，導(dǎo)致傳統(tǒng)疫苗免疫效果有所降低，因此，研發(fā)防控ND和IBD的新型疫苗顯得尤為重要。減毒沙門菌作為疫苗活載體是一種天然的黏膜免疫增強(qiáng)劑，可以實現(xiàn)多種抗原的遞呈，經(jīng)口服免疫可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的的黏膜、體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，本研究采用asd+宿主-載體平衡致死系統(tǒng)，將NDV HN和IBDV VP2基因串聯(lián)克隆至無抗性表達(dá)載體pYA3493中，并電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒

3、沙門菌，成功構(gòu)建了表達(dá)HN和VP2融合蛋白的重組減毒沙門菌候選疫苗，對其生物學(xué)及免疫學(xué)特性進(jìn)行研究，為新城疫-傳染性法氏囊-鼠傷寒沙門菌的三聯(lián)口服疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　1. NDV HN和IBDV VP2融合蛋白的原核表達(dá)及鑒定
　　以攜帶NDV HN基因及IBDV VP2基因的的pMD18-T-HN、pMD18-T-VP2為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增HN基因及VP2基因的主要抗原表位區(qū)，并通過重疊延伸PCR將HN和VP2基因片

4、段拼接成融合片段，并克隆至pMD19-T，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-HN-VP2，經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定正確后，將融合基因片段HN-VP2連接至表達(dá)載體pET32a，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE及Western blotting鑒定結(jié)果顯示，融合蛋白HN-VP2在Rosetta菌株中成功表達(dá)，大小為104 kDa，并能夠被his單抗識別，具有良好的免疫反應(yīng)性。
　　2.表達(dá)NDV HN和I

5、BDV VP2融合蛋白的重組沙門菌的構(gòu)建及生物學(xué)特性分析
　　將NDV HN和IBDV VP2融合基因定向插入至無抗性原核表達(dá)載體pYA3493中，并將重組質(zhì)粒pYA-HN-VP2電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門菌SL1344Δcrp?cya?asd中，獲得減毒重組菌SL1344Δcrp?cya?asd(pYA-HN-VP2)，并分析其生物學(xué)特性。Western blot結(jié)果顯示減毒重組菌可穩(wěn)定分泌表達(dá)HN-VP2融合蛋白，大小為84 kD

6、a，且該融合蛋白分別能與HN抗體、VP2抗體發(fā)生反應(yīng)，具有較好的免疫反應(yīng)性。生物學(xué)特性結(jié)果顯示重組菌株利用碳源的能力降低，生長速度減慢，毒力較SL1344至少下降105，并具有良好的侵襲性，且重組質(zhì)粒pYA-HN-VP2在減毒沙門菌中可穩(wěn)定遺傳。
　　3.減毒重組菌SL1344Δcrp?cya?asd(pYA-HN-VP2)的免疫學(xué)特性研究
　　為測定重組菌 SL1344Δcrp?cya?asd(pYA-HN-VP2)口服免

7、疫后誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平。本研究將重組菌 SL1344Δcrp?cya?asd(pYA-HN-VP2)口服免疫雛雞，免疫2次，每次間隔7d，并設(shè) SL1344Δcrp?cya?asd(pYA-HN)、SL1344Δcrp?cya?asd(pYA-VP2)、空載體、PBS及新城疫Ⅳ系與傳染性法氏囊疫苗對照組。并于免疫后0d、7d、14d、21d、28d、35d、42d測定各組雛雞生長發(fā)育、NDV抗體、VP2抗體、腸黏膜sIgA和淋巴

8、細(xì)胞分化水平，以及評價重組菌的保護(hù)率。結(jié)果顯示，與對照組相比，重組菌可顯著刺激雞體免疫器官的生長發(fā)育，但對雛雞體重的影響無顯著差異(P＞0.05)；免疫后第7d，雛雞開始產(chǎn)生NDV HI抗體和VP2抗體，并于免疫后28d時達(dá)到最高，與對照組相比具有極顯著差異（P＜0.01）；腸道黏膜sIgA抗體檢測結(jié)果顯示，重組菌能夠誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生較高水平的sIgA抗體，抗體水平于免疫后28d達(dá)到高峰；淋巴細(xì)胞增殖試驗結(jié)果表明重組菌能夠刺激外周血淋巴細(xì)胞