利用多重PCR一次檢測侵染大豆的幾種檢疫性病毒及大豆內(nèi)源基因的研究.pdf

1、大豆作為世界上最為重要的一種經(jīng)濟作物，每年在各個國家都有大宗的貿(mào)易份額，在其生長過程中會受到多種真菌、細菌、病毒、線蟲、昆蟲等病原物的侵染。菜豆莢斑駁病毒(Beanpodmottlevirus，BPMV)、煙草環(huán)斑病毒(Tobaccoringspotvirus，TRSV)和番茄環(huán)斑病毒(Tomatoringspotvirus，ToRSV)均是危害大豆的重要病毒，也是我國的主要檢疫對象，建立其多重PCR的快速檢測體系，提高病毒的檢測效率，

2、為快驗快放服務。
　　 本研究以帶有BPMV、TRSV和ToRSV的大豆種子為實驗材料，根據(jù)BPMV、TRSV、ToRSV的CP基因設計合成多對引物，然后進行單基因PCR反應特異性驗證，同時選擇大豆內(nèi)源基因(BD30K)作為參照物，確保RNA提取、cDNA第一鏈合成及PCR等過程被正確操作，防止假陰性結(jié)果的發(fā)生。在此基礎上合理組合各對引物并調(diào)整、優(yōu)化多重PCR反應條件，最終確立了四對特異性引物和多重PCR的反應條件，選用的引物分

3、別可擴增BPMV275bp，TRSV580bp，ToRSV794bp，BD30K104bp的特異性片段，反應條件則在普通PCR的基礎上調(diào)整反應緩沖液濃度至1.4X，BD30K的引物濃度為其他引物的2倍，在此條件下我們建立了同時檢測大豆種子中BPMV、TRSV、ToRSV及大豆內(nèi)源基因BD30K的多重RT-PCR體系。
　　 研究結(jié)果表明，同步檢測的特異性和靈敏度均好；能夠檢測到BPMV、TRSV、ToRSV和BD30K的RNA最

4、低含量分別為0.9ng、0.186ng、8.0pg、3.8ng；攜帶三種病毒的大豆種子混合后提取的RNA的最低檢測含量為1.16ng。表明建立的多重PCR檢測方法特異性強，靈敏度高，可操作性強，大大縮短了檢測時間，簡化了操作步驟，具有較強的應用價值，適合口岸對進境大豆種子中這3種病毒的快速檢測，在出入境檢驗檢疫中具有廣泛的應用前景。
　　 本研究還建立了大豆種子中BPMV和TRSV單管雙重實時熒光PCR檢測方法。將含有相同濃度的

5、分別帶有BPMV和TRSVCP基因的質(zhì)粒溶液作為陽性對照，以受2種病毒侵染的大豆種子作為實驗樣品進行實時熒光PCR檢測，結(jié)果表明能從同一管中同時檢測出這兩種病毒而不發(fā)生交叉反應。盡管在陽性對照中，二者的檢測限相當，均可達到35pg/mL，但在實際應用中，兩種病毒由于在大豆種子中的濃度不一致而存在一定的差別。同時將實時熒光靈敏度與DAS-ELISA和RT-PCR檢測靈敏度進行比較，結(jié)果表明實時熒光PCR檢測BPMV和TRSV的靈敏度分別是