蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、引言
　　類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthrits，RA)是主要累及小關(guān)節(jié)的滑膜慢性炎癥，屬于自身免疫性疾病范疇，常常會(huì)引起關(guān)節(jié)腫痛、軟骨破壞、關(guān)節(jié)間隙變窄、關(guān)節(jié)畸形等改變，若得不到及時(shí)和正確的診治會(huì)造成人體不同程度的殘疾[1]。該病屬于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的痹癥范疇，常見(jiàn)癥型有4種:風(fēng)寒濕痹、風(fēng)濕熱痹、痰瘀痹阻、肝腎陰虛等。RA患者骨與關(guān)節(jié)的早期病理變化是骨質(zhì)疏松(Osteoporosis，Op)，有研究指出RA患者普遍存在骨量

2、流失的現(xiàn)象。Wnt信號(hào)通路在炎癥與骨代謝方面發(fā)揮重要作用，主要通過(guò)Wnt家族蛋白或信號(hào)通路上相關(guān)蛋白通過(guò)自分泌或旁分泌的方式與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合，激活細(xì)胞質(zhì)中的對(duì)應(yīng)信號(hào)分子，從而促進(jìn)下游基因轉(zhuǎn)錄。蜂毒素（Melittin），是蜂毒中具有藥物作用的主要活性物質(zhì)，具有抗炎、抗菌與鎮(zhèn)痛藥用價(jià)值。有研究表明蜂毒素能夠有效抑制多種病原微生物生長(zhǎng)。蜂針、蜂療已有千年歷史，尤其是在治療關(guān)節(jié)炎等炎性疼痛方面，療效顯著。但蜂毒素存在易溶血和易過(guò)敏的不良

3、反應(yīng)，限制其應(yīng)用范圍。杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)為落葉喬木，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載杜仲“主治腰膝痛，補(bǔ)中，益精氣，堅(jiān)筋骨，除陰下癢濕，小便余瀝。久服，輕身耐老”的作用。杜仲是中國(guó)特有藥材，廣泛應(yīng)用于臨床，其性甘，溫。歸肝、腎經(jīng)?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn):杜仲對(duì)中樞神經(jīng)、循環(huán)、免疫、內(nèi)分泌、泌尿系統(tǒng)均存在不同程度的調(diào)節(jié)作用。有大量研究表明杜仲提取物在體外有較顯著的抗氧化溶血而保護(hù)紅細(xì)胞的作用。杜仲黃酮是杜仲的有效提取物。

4、蜂毒素具有易溶血的不良反應(yīng)，而杜仲具有明顯的抗溶血作用，故將二者聯(lián)合使用觀察杜仲能否減輕蜂毒素的溶血作用，進(jìn)而增加抗炎作用。
　　本文從細(xì)胞、分子、動(dòng)物層面探究蜂毒素、杜仲黃酮單用及聯(lián)合給藥的最佳藥物濃度及治療效果。研究發(fā)現(xiàn)CIA模型小鼠關(guān)節(jié)會(huì)出現(xiàn)骨量不均的現(xiàn)象，與人類(lèi)RA的早期病理改變——骨質(zhì)疏松相似，中醫(yī)強(qiáng)調(diào)關(guān)節(jié)乃骨之連接，筋脈聚集之所，肝主筋、腎主骨，本文在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了肝腎陰虛型類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床發(fā)病情況及與骨質(zhì)疏松

5、的關(guān)聯(lián)的探討。
　　本論文共分為三部分研究?jī)?nèi)容。
　　第一部分蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮通過(guò)WNT信號(hào)通路抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制的研究
　　目的:
　　探究蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路上Wnt-1，Dkk-1，C-myc，β-catenin蛋白抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)機(jī)制。
　　方法:
　　選擇類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(RA-FLS)培養(yǎng)至3-7代，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞

6、表面標(biāo)記抗體，驗(yàn)汪為RA-FLS細(xì)胞。待細(xì)胞增殖至適當(dāng)數(shù)目后接種于六孔板中，除空白對(duì)照外其余各孔加入10ng/mL TNF-α誘導(dǎo)RA-FLS細(xì)胞成為異常增殖的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型。用不同濃度的蜂毒素、杜仲黃酮、蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮混合制劑處理RA-FLS細(xì)胞模型，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。Western Blot檢測(cè)不同處理組Wnt-1、β-catenin、C-myc及DKK-1蛋白的表達(dá)情況。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用SPSS19.0進(jìn)行整理與

7、分析。
　　結(jié)果:
　　濃度為1、10、100、1000ng/μL的蜂毒素、杜仲黃酮無(wú)論是單獨(dú)還是聯(lián)合使用均可以有效地減低RA-FLS的生存率。其中藥物濃度為1000ng/μL蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮對(duì)細(xì)胞抑制率最高，達(dá)到89.73％。用藥后Wnt-1、β-catenin、C-myc、DKK-1蛋白的表達(dá)量均較TNF-A誘導(dǎo)的RA-FLS模型組明顯降低，蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮組的蛋白含量最低。(p＜0.05)
　　結(jié)論:

8、　　蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮能夠有效抑制被TNF-α誘導(dǎo)刺激異常增殖的RA-FLS的生長(zhǎng)，藥物濃度為1000ng/μL效果最好，作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制Wmt信號(hào)通路Wnt1、β-catenin、C-myc、DKK-1蛋白的表達(dá)。
　　第二部分外用蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮治療膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠模型
　　目的:
　　觀察外用蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮治療膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠模型的效果。
　　方法:
　　將昆明小鼠分為空白對(duì)照組與

9、造模組，造模組按照膠原誘導(dǎo)型(CIA)小鼠造模方法制備成關(guān)節(jié)炎小鼠，分為PBS組、蜂毒素組、杜仲黃酮組及混合給藥組。按分組不同，每組給予不同的藥物（藥物濃度均為1μg/μL）外涂。每只足爪給予5μL藥物，共給藥15天，PBS對(duì)照組給予等量的PBS。每日測(cè)量小鼠的足墊厚度及踝關(guān)節(jié)的寬度;給藥前后均進(jìn)行足爪部位X線檢查;待給藥結(jié)束后處死小鼠，ELISA法檢測(cè)相關(guān)因子(TNF-α、IL-1β、IL-2、GM-CSF);計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度及脾指數(shù)。

10、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)處理。
　　結(jié)果:
　　肉眼觀察可見(jiàn)，蜂毒素、杜仲黃酮及混合給藥組的小鼠足爪的腫脹程度均輕于造模PBS組;通過(guò)足墊厚度、足踝寬度及足爪腫脹度測(cè)量比較后發(fā)現(xiàn)，給藥組小鼠的關(guān)節(jié)腫脹情況均得到緩解，其中混合給藥組小鼠的關(guān)節(jié)改善情況優(yōu)于其他組(p＜0.05);ELISA檢測(cè)小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-2、GM-CSF等炎癥因子發(fā)現(xiàn)，混合給藥組小鼠各項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)改變優(yōu)于其他組(p＜0.05)

11、。
　　結(jié)論:
　　外涂蜂毒素、杜仲黃酮、蜂毒素聯(lián)合杜仲黃酮均可以有效改善CIA小鼠的關(guān)節(jié)腫脹情況，其中混合給藥組效果最好，具體的作用機(jī)制可能是抑制相關(guān)炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-2、GM-CSF）的表達(dá)。
　　第三部分:肝腎陰虛型類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與骨質(zhì)疏松相關(guān)性臨床研究
　　目的:
　　探究肝腎陰虛型RA患者伴發(fā)骨質(zhì)疏松的發(fā)生情況，并從類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)指標(biāo)、急性炎癥指標(biāo)、骨代謝指標(biāo)、骨密度結(jié)果分析

12、其相關(guān)性。
　　方法:
　　選擇2015年10月～2016年5月來(lái)自上海光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院關(guān)節(jié)內(nèi)科的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎住院病人。參與研究的患者應(yīng)排除相關(guān)禁忌，參與本研究前未進(jìn)行過(guò)正規(guī)抗骨質(zhì)疏松治療，且女性均為絕經(jīng)后患者，男性年紀(jì)均超過(guò)50歲。完成相關(guān)調(diào)查表的填寫(xiě)，主要對(duì)其血常規(guī)、急性炎癥指標(biāo)(血沉ESR，C-反應(yīng)蛋白CRP)、類(lèi)風(fēng)濕因子(IgM RF、IgARF、IgGRF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP抗體）、骨代謝指標(biāo)(骨鈣素O

13、T;I型膠原交聯(lián)C末端肽CTX;I型膠原N端前肽PINP;甲狀旁腺激素PTH;1，25(OH)2D3)檢測(cè)數(shù)值、腰椎和左髖部進(jìn)行常規(guī)骨密度(BMD)數(shù)值的填寫(xiě)。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用SPSS19.0進(jìn)行整理與分析。
　　結(jié)果:
　　共64名RA患者參與研究，其中30人同時(shí)伴發(fā)骨質(zhì)疏松(46.88％)。患者的血紅蛋白值在骨量正常與骨量減少、骨量正常與骨質(zhì)疏松組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，骨量正常組的血紅蛋白數(shù)值較高?？笴CP抗體、IgMRF與

14、髖部BMD水平呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。年齡、抗CCP抗體滴度、ESR情況均為是否發(fā)生伴發(fā)骨質(zhì)疏松的危險(xiǎn)因素。年齡大于65歲患者較其他患者骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)多一倍;高滴度抗CCP抗體患者腰椎OP的發(fā)生情況比其他患者高13倍;高滴度抗CCP抗體患者髖部OP的發(fā)生情況其他患者的4倍余;血沉異常患者的腰椎及髖部OP的發(fā)生情況均較其他患者多9倍。
　　結(jié)論:
　　年齡大于65歲，抗CCP抗體和ESR水平較高、血紅蛋白水平較低的肝腎陰虛型RA患