白藜蘆醇對(duì)肥胖哮喘大鼠模型的氧化應(yīng)激抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　近年來在全球范圍內(nèi)，無論成人還是兒童，肥胖及支氣管哮喘兩大疾病的發(fā)病率均迅速上升。肥胖引發(fā)的血脂血糖代謝異常增加了患者糖尿病、心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)，且對(duì)于兒童患者目前并無安全的降脂藥物應(yīng)用于臨床。支氣管哮喘是一種氣道變態(tài)反應(yīng)性炎癥，哮喘急性發(fā)作嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，重者可致死。流行病學(xué)顯示，肥胖與哮喘存在一定聯(lián)系，肥胖增加了哮喘的患病率和發(fā)病率，肥胖人群比非肥胖人群更容易出現(xiàn)喘息癥狀且癥狀更重；肥胖伴哮喘患者對(duì)治療哮喘

2、常規(guī)藥物如糖皮質(zhì)激素和膽堿能藥物的反應(yīng)性通常較差，癥狀不易控制。但是也有研究認(rèn)為肥胖并不會(huì)引起氣道高反應(yīng)性。故目前肥胖與哮喘的相關(guān)性并不十分確切，并且這種關(guān)聯(lián)的機(jī)制仍不清楚。因此探索此兩種疾病是否有共同的發(fā)病機(jī)制，并找到合適的藥物進(jìn)行干預(yù)，使得降低患者肥胖并發(fā)癥的同時(shí)給肥胖哮喘患者的治療提供思路是本研究的目的所在。
　　氧化應(yīng)激是指有害刺激導(dǎo)致體內(nèi)高活性分子如活性氮族(Reactive Nitrogen Species，RNS)和

3、活性氧族(Reactive Oxygen Species，ROS)產(chǎn)生過多,氧化程度超出機(jī)體清除能力，從而導(dǎo)致組織損傷。氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的活性分子通過不同途徑損傷細(xì)胞蛋白、核酸等的生理功能，是許多疾病發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)。近年來，在肥胖與其相關(guān)疾病如糖尿病、心血管疾病的研究中發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平較正常人群升高。哮喘發(fā)生過程中許多系統(tǒng)和物質(zhì)被激活，進(jìn)而發(fā)生炎癥反應(yīng)失調(diào)，哮喘發(fā)病機(jī)制中存在肥胖引起氧化應(yīng)激的相同炎癥因子，故推測(cè)氧化應(yīng)

4、激可能為肥胖并哮喘的共同且重要的發(fā)病機(jī)制。
　　Keap1-Nrf2信號(hào)通路在機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的機(jī)制中具有重要地位，是細(xì)胞防御系統(tǒng)的重要成員，該通路在包括哮喘在內(nèi)的多種呼吸道疾病中處于活化狀態(tài)。在無應(yīng)激的狀態(tài)下，Nrf2與其負(fù)調(diào)控因子Keap1相互作用并形成Nrf2/Keap1復(fù)合物，Nrf2通過該復(fù)合蛋白的降解而泛化降解。在應(yīng)激的狀態(tài)下，P-Nrf2/Keap1復(fù)合物便轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核并與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant re

5、sponse element，ARE）相結(jié)合，從而激活多種抗氧化基因。Keap1-Nrf2通路在機(jī)體抗炎，抗氧化應(yīng)激等生物過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　白藜蘆醇(Resveratrol,RSV)是虎杖、葡萄、決明子和花生等天然植物中的一種有效成分，是具有二苯乙烯類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物。白藜蘆醇具有毒性低、作用廣的優(yōu)勢(shì)，因此成為國(guó)內(nèi)外諸多研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。近年研究顯示白藜蘆醇具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用。白藜蘆醇能與脂蛋白結(jié)合，而增

6、強(qiáng)后者的抗氧化性，減少低密度脂蛋白的氧化和膽固醇在動(dòng)脈中的沉積，從而可以降低高脂血癥以及動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)也有研究證實(shí)白藜蘆醇對(duì)肺部疾病如肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病、肺動(dòng)脈高壓、急性肺損傷等均有一定的治療效果。白藜蘆醇對(duì)胖哮喘肥大鼠模型氧化應(yīng)激的干預(yù)研究目前尚無報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)選用白藜蘆醇干預(yù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，旨在明確白藜蘆醇對(duì)高脂膳食肥胖哮喘大鼠氧化應(yīng)激的抑制作用，并進(jìn)一步探索白藜蘆醇是否通過對(duì)Keap1/Nrf2通路的作用抑制氧化

7、應(yīng)激，為肥胖哮喘的發(fā)病機(jī)制研究以及肥胖哮喘今后的藥物治療提供實(shí)驗(yàn)參考。
　　目的：
　　1.通過對(duì)比3T3-L1脂肪細(xì)胞及不同濃度白藜蘆醇培養(yǎng)后的脂肪細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中活性氧及抗氧化應(yīng)激因子的含量，在細(xì)胞水平探討白藜蘆醇對(duì)肥胖性哮喘氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用。
　　2.建立大鼠高脂膳食肥胖、哮喘及肥胖哮喘動(dòng)物模型，明確白藜蘆醇對(duì)糖脂代謝的影響；為肥胖哮喘動(dòng)物模型的建立提供依據(jù)
　　3.檢測(cè)肥胖、哮喘及肥胖哮喘大鼠模型

8、體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)情況，探討Keap1-Nrf2通路在肥胖哮喘大鼠模型發(fā)病機(jī)制中的重要作用。
　　4.給予抗氧化劑白藜蘆醇干預(yù)肥胖、哮喘及肥胖哮喘大鼠模型，探討白藜蘆醇對(duì)于機(jī)體內(nèi)細(xì)胞氧化應(yīng)激的抑制作用，進(jìn)一步探索白藜蘆醇是否通過 Keap1-Nrf2通路對(duì)肥胖性哮喘氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮的抑制作用。
　　方法：
　　1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：（1）3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)；（2）用成脂誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)

9、胞，油紅O鑒定成脂誘導(dǎo)效果；（3）白藜蘆醇（10μmol/L）、白藜蘆醇（50μmol/L）分別干預(yù)3T3-L1脂肪細(xì)胞后，對(duì)對(duì)照組脂肪細(xì)胞和不同濃度白藜蘆醇干預(yù)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、比色法測(cè)定還原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、過氧化氫酶（H2O2）活性和總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性；（4） real-time PCR測(cè)定對(duì)照組細(xì)胞和不同濃度白藜蘆醇干預(yù)組脂肪細(xì)胞K

10、eap1和Nrf2的mRNA表達(dá)。
　　2.建立大鼠模型：（1）通過高脂飲食誘導(dǎo)建立肥胖大鼠模型；（2）通過經(jīng)典的慢性哮喘大鼠氣道重塑模型的誘導(dǎo)，即 O VA（雞卵清蛋白）致敏和激發(fā)，建立哮喘大鼠模型；（3）OVA（雞卵清蛋白）致敏和激發(fā)肥胖大鼠，建立肥胖哮喘大鼠模型；（4）通過血清生化及ELISA法檢測(cè)肥胖、哮喘、肥胖哮喘組大鼠的血糖、血脂指標(biāo)；（5）石蠟切片HE染色法觀察各組大鼠的心、肺、腎臟脂肪細(xì)胞形態(tài)及支氣管和肺泡病理學(xué)改

11、變。
　　3.大鼠模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：（1）將大鼠分為七組：正常組、肥胖組、哮喘組、肥胖哮喘組、0.03%RSV干預(yù)肥胖組、0.03%RSV干預(yù)哮喘組和0.03%RSV干預(yù)肥胖哮喘組；（2）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平；（3）比色法測(cè)定各組大鼠心、肺和腎臟組織內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、過氧化氫酶（H2O2）活性和總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性；（4）real-time PCR測(cè)定大鼠心

12、、肺和腎臟組織內(nèi) Keap1和 Nrf2的mRNA表達(dá)；（5）Western Blot測(cè)定大鼠心、肺和腎臟組織內(nèi)Keap1和Nrf2的蛋白質(zhì)表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.白藜蘆醇對(duì)脂肪細(xì)胞氧化應(yīng)激的抑制作用：（1）3T3-L1脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化：油紅染色結(jié)果胞漿內(nèi)含有大量的淡紅色脂滴，提示3T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成功；（2）10μmol/L RSV和50μmol/L RSV干預(yù)的3T3-L1脂肪細(xì)胞組ROS水平較對(duì)照組

13、顯著降低（P<0.05）；（3）10μmol/L RSV和50μmol/L RSV干預(yù)的3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)GSH含量、GSH-Px酶、H2O2酶和SOD酶活性明顯增高，與對(duì)照組相比具有顯著性差異（P<0.01），且高濃度RSV干預(yù)組上述抗氧化應(yīng)激因子和酶活性增高更明顯；（4）10μmol/L RSV和50μmol/L RSV干預(yù)的3T3-L1脂肪細(xì)胞組Keap1 mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（P<0.05），而Nrf2基因的mRN

14、A表達(dá)水平明顯升高，與對(duì)照組相比具有顯著性差異（P<0.05）。
　　2.肥胖、哮喘及肥胖哮喘大鼠模型的建立、分組及相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)：（1）成功建立肥胖、哮喘和肥胖哮喘大鼠模型；（2）肥胖、哮喘、肥胖哮喘組血糖水平顯著高于正常對(duì)照組（7.7mmol/L，8.1mmol/L，8.5mmol/L.vs.4.6mmol/L,P<0.05），0.03%RSV哮喘組，0.03%RSV肥胖組，0.03%RSV肥胖哮喘組血糖水平明顯降低，與肥胖、

15、哮喘、肥胖哮喘組相比具有顯著性差異（P<0.05）；（3）肥胖、哮喘、肥胖哮喘組高密度脂蛋白膽固醇水平顯著低于正常對(duì)照組（0.451mmol/L，0.452mmol/L，0.28mmol/L.vs.0.895mmol/L,P<0.01），0.03%RSV哮喘組，0.03%RSV肥胖組，0.03%RSV肥胖哮喘組高密度脂蛋白膽固醇水平明顯升高，分別與肥胖、哮喘、肥胖哮喘組相比具有顯著性差異（P<0.05），肥胖、哮喘、肥胖哮喘組甘油三酯、

16、總膽固醇、極低密度脂蛋白水平顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），0.03%RSV哮喘組，0.03% RSV肥胖組，0.03% RSV肥胖哮喘組甘油三酯、總膽固醇、極低密度脂蛋白水平明顯降低，與肥胖、哮喘、肥胖哮喘組相比具有顯著性差異（P<0.05）；（4）肥胖、哮喘、肥胖哮喘組脂肪細(xì)胞肥大，組織細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞間距增大，各細(xì)胞之間排列不緊密，其間散在炎癥細(xì)胞分布，肥胖哮喘組改變更為顯著，0.03% RSV干預(yù)后肥胖組、哮喘組和肥胖哮喘

17、組細(xì)胞肥大減輕、組織細(xì)胞數(shù)量明顯增加；（5）哮喘組及肥胖哮喘組大鼠氣道黏膜水腫明顯，上皮不完整，管腔內(nèi)充滿炎性分泌物，管腔狹窄甚至閉塞，平滑肌及基底膜明顯增厚，白藜蘆醇干預(yù)后上述病理變化均有不同程度的減輕。
　　3.白藜蘆醇對(duì)大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激的抑制作用：（1）肥胖、哮喘、肥胖哮喘組心、肺、腎臟組織細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），其中肥胖哮喘組的心、肺、腎組織活性氧水平最高；0.03%RSV干預(yù)后哮喘組、肥胖組、

18、肥胖哮喘組活性氧水平明顯降低，與未接受0.03%RSV干預(yù)的肥胖、哮喘、肥胖哮喘組相比具有顯著性差異（P<0.05），其中哮喘組、肥胖組活性氧水平降低幅度相似，而肥胖哮喘組活性氧水平降低幅度最大，上述結(jié)果表明白藜蘆醇的對(duì)于肥胖及哮喘的活性氧水平具有明顯抑制作用；（2）同組大鼠的心、肺、腎組織細(xì)胞內(nèi)GSH、GSH-Px、H2O2、SOD酶活性水平基本一致，肥胖、哮喘、肥胖哮喘組心、肺、腎臟組織細(xì)胞內(nèi)GSH、GSH-Px、H2O2、SOD酶

19、活性等抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05），0.03%RSV哮喘組，0.03%RSV肥胖組，0.03% RSV肥胖哮喘組抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性較未干預(yù)組大鼠明顯升高，并具有顯著性差異（P<0.05），其中哮喘組、肥胖組抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性升高幅度相似，而肥胖哮喘組抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性升高幅度較前兩組小，這表明白藜蘆醇的對(duì)于肥胖及哮喘氧化應(yīng)激反應(yīng)中相關(guān)抗氧化酶的活性具有促進(jìn)作用；（3）肥胖、哮喘、肥胖哮喘組心、肺、腎臟組織

20、細(xì)胞內(nèi) Keap-1 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P<0.05），0.03%RSV哮喘組，0.03%RSV肥胖組，0.03%RSV肥胖哮喘組心、肺、腎臟組織細(xì)胞內(nèi)Keap-1 mRNA表達(dá)水平明顯低于肥胖、哮喘、肥胖哮喘組，具有顯著性差異（P<0.05），肥胖、哮喘、肥胖哮喘組心、肺、腎臟組織細(xì)胞內(nèi) Nrf2 mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（P<0.05），0.03%RSV哮喘組，0.03%RSV肥胖組，0.03%RSV肥胖哮喘組心

21、、肺、腎臟組織細(xì)胞內(nèi)Nrf2 mRNA表達(dá)水平明顯升高，與肥胖、哮喘、肥胖哮喘組相比具有顯著性差異（P<0.05），這表明在mRNA水平，白藜蘆醇的對(duì)于肥胖及哮喘大鼠細(xì)胞Keap-1／Nrf2信號(hào)通路具有的激活作用，同時(shí)說明白藜蘆醇可通過激活Keap-1／Nrf2信號(hào)通路抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激的水平；（4）肥胖、哮喘、肥胖哮喘組心臟、肺、腎臟組織細(xì)胞內(nèi)KEAP-1蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05），0.03%RSV哮喘組，0.03

22、%RSV肥胖組，0.03%RSV肥胖哮喘組心臟、肺、腎臟組織細(xì)胞內(nèi)KEAP-1蛋白表達(dá)水平明顯低于肥胖、哮喘、肥胖哮喘組，并具有顯著性差異（P<0.05），肥胖、哮喘、肥胖哮喘組心臟、肺、腎臟組織細(xì)胞內(nèi)NrF2蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組（P<0.05），0.03%RSV哮喘組，0.03%RSV肥胖組，0.03%RSV肥胖哮喘組心臟、肺、腎臟組織細(xì)胞內(nèi) NrF2蛋白表達(dá)水平較肥胖、哮喘、肥胖哮喘組明顯升高，具有顯著性差異（P<0.05

23、），這些現(xiàn)象表明在蛋白水平，白藜蘆醇的對(duì)于肥胖及哮喘大鼠細(xì)胞Keap-1／Nrf2信號(hào)通路蛋白表達(dá)具有激活作用，同時(shí)證明白藜蘆醇可通過激活Keap-1／Nrf2信號(hào)通路抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平。
　　結(jié)論：
　　1.本研究成功建立大鼠高脂膳食肥胖哮喘動(dòng)物模型；
　　2.明確了氧化應(yīng)激在肥胖和哮喘的發(fā)生及發(fā)展中起著重要作用，肥胖和哮喘可以通過協(xié)同或疊加效應(yīng)，降低大鼠體內(nèi)抗氧化因子的量和抗氧化酶類的活性來增加肥胖哮喘大鼠體