白藜蘆醇減輕小鼠心肌應(yīng)激性損傷的分子作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　應(yīng)激為機(jī)體在各種非致死性內(nèi)外環(huán)境因素刺激下所出現(xiàn)的全身性非特異性適應(yīng)反應(yīng)。適度的應(yīng)激反應(yīng)對機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用，而應(yīng)激反應(yīng)過激可使體內(nèi)的多個器官受到不同程度的損傷。心臟作為機(jī)體循環(huán)的樞紐，是應(yīng)激損傷的主要靶器官之一。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,各種致死性創(chuàng)傷對人們機(jī)體所造成的直接危害逐年減少,而非致死性創(chuàng)傷（如自然災(zāi)害、交通事故、親人亡故等事件）所引起機(jī)體組織器官的應(yīng)激性損傷卻日益增加。以往利用非致死性創(chuàng)傷模型的研究發(fā)現(xiàn)，非致

2、死性創(chuàng)傷可造成心臟的隱匿性損傷，非致死性創(chuàng)傷后心肌細(xì)胞可出現(xiàn)顯著的凋亡，這種凋亡能夠繼發(fā)心臟功能障礙,甚至可以導(dǎo)致死亡。因此,如何預(yù)防和減輕各種刺激對心臟所造成的應(yīng)激性損傷亟為必要。
　　白藜蘆醇(Resveratrol,Res)是一種天然的具有多種生物學(xué)效應(yīng)的多酚類化合物，研究證實在預(yù)治腫瘤以及神經(jīng)退行性病變等方面具有重要作用。近年來關(guān)于白藜蘆醇在心肌保護(hù)方面的作用研究已成為該領(lǐng)域的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能夠激發(fā)機(jī)體內(nèi)源性

3、物質(zhì)-AMP的生成水平減輕心肌缺血/再灌注損傷來發(fā)揮心肌保護(hù)作用。但白藜蘆醇是否可以減輕非致死性創(chuàng)傷所引起的心肌應(yīng)激性損傷，以及其具體的分子作用機(jī)制尚不清楚。
　　STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子家族中的一員，在機(jī)體不同的細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)，廣泛參與細(xì)胞的生長、分化、凋亡等多種生理功能調(diào)控，并與炎癥、腫瘤和免疫反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)。以往研究表明，STAT3信號通路的活化很可能賦予心肌細(xì)胞抗凋亡的特性。Survivin是凋亡抑制蛋

4、白(inhibitorofapoptosisprotein,IAP)家族中的一個重要成員，廣泛地表達(dá)于大多數(shù)腫瘤組織、人類胚胎發(fā)育組織、造血干細(xì)胞、分泌期子宮內(nèi)膜、早期絨毛以及蛻膜組織。它是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強的凋亡抑制因子。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)心肌受到缺血損傷時，心肌細(xì)胞中Survivin的表達(dá)就會上調(diào)，發(fā)揮其抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)損傷修復(fù)以及促血管新生等作用。另外，在乳腺癌細(xì)胞中激活STAT3，可以上調(diào)Survivin的表達(dá)。因此，我們假設(shè)：白藜

5、蘆醇減輕非致死性創(chuàng)傷所引起的心肌應(yīng)激性損傷，并且這種保護(hù)作用的分子機(jī)制可能是通過激活STAT3信號通路上調(diào)Survivin相關(guān)。本研究擬對該假設(shè)進(jìn)行驗證，并進(jìn)而闡明白藜蘆醇保護(hù)心肌應(yīng)激性損傷的分子機(jī)制，有助于深化對白藜蘆醇心血管保護(hù)功能新機(jī)制的認(rèn)識，為心肌應(yīng)激性損傷的防護(hù)提供新的理論依據(jù)和策略。
　　研究目的：
　　1、觀察非致死性創(chuàng)傷所引起的應(yīng)激對小鼠心肌損傷情況（心功能、心肌凋亡）。
　　2、明確白藜蘆醇對非致死性

6、創(chuàng)傷所引起的小鼠心肌應(yīng)激性損傷的抑制作用。
　　3、初步探討白藜蘆醇抑制心肌應(yīng)激性損傷作用的分子機(jī)制。
　　實驗方法：
　　1、白藜蘆醇濃度梯度實驗：白藜蘆醇用環(huán)糊精溶解，根據(jù)白藜蘆醇的注射濃度不同將40只小鼠隨機(jī)分為四組，即：對照組（Control）、5μM白藜蘆醇組（Res-5）、10μM白藜蘆醇組（Res-10）、20μM白藜蘆醇組（Res-20），每組各10只。Control組小鼠每天腹腔注射0.2ml環(huán)糊精，

7、其余三組小鼠每天分別腹腔注射0.2ml不同濃度的Res，安靜環(huán)境飼養(yǎng)一周后檢測所有小鼠心功能。
　　2、非致死性創(chuàng)傷小鼠模型：用1％的吸入式麻醉劑（異氟烷）麻醉雄性成年昆明小鼠（20-25g）。將麻醉完全的小鼠放入Noble-Collip鼓中，以40轉(zhuǎn)/分的速率轉(zhuǎn)動5分鐘誘導(dǎo)小鼠在受到非致死性創(chuàng)傷時全身器官產(chǎn)生應(yīng)激性創(chuàng)傷，建立非致死性創(chuàng)傷小鼠模型。假創(chuàng)傷組按相同步驟放入同一創(chuàng)傷儀中，轉(zhuǎn)動過程中將小鼠黏貼在鼓的內(nèi)壁上以避免創(chuàng)傷損害。

8、
　　3、高分辨小動物超聲成像系統(tǒng)檢測小鼠心功能：按照高分辨小動物超聲成像系統(tǒng)(Vevo770，VisualSonics，Canada)的操作說明，對小鼠進(jìn)行氣體吸入式麻醉（異氟烷與氧氣混合氣），麻醉后將其置于37℃的恒溫墊上，用4個電極連接小鼠四肢末端并固定。運用RMV707B型高頻超聲探頭對小鼠進(jìn)行超聲心動圖檢查，由VisualSonicsVevo770TM軟件自動計算得出左室舒張末期容積(LVEDV)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF

9、％)、左室短軸縮短率(LVFS％)和E/A值、E峰減速時間（EDT）等各種心功能的各種收縮和舒張指標(biāo)，每組原始數(shù)據(jù)取連續(xù)3個心動周期的平均值。
　　4、心肌細(xì)胞凋亡測定：①利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測小鼠心肌細(xì)胞凋亡的變化；②檢測心肌組織中Caspase-3的活性。
　　5、STAT3、p-STAT3磷酸化水平及Survivin蛋白表達(dá)：采用Western-blot檢測。
　　

10、實驗結(jié)果：
　　1、與對照組（0μMRes）相比，腹腔注射白藜蘆醇的小鼠左室射血分?jǐn)?shù)均增高（P<0.05），但左室射血分?jǐn)?shù)與白藜蘆醇不存在劑量依賴關(guān)系。10μM白藜蘆醇組小鼠左室射血分?jǐn)?shù)最高，與其它3組相比有顯著性差異（P<0.01）。20μM白藜蘆醇組小鼠左室射血分?jǐn)?shù)反而比5μM白藜蘆醇組的要低，但較對照組要高。左室射血分?jǐn)?shù)不受多種因素，尤其是心率的干擾，能夠很好反映心臟收縮功能，因此，白藜蘆醇濃度梯度實驗結(jié)果表明，10μM的白

11、藜蘆醇心肌保護(hù)作用最好。故在后續(xù)實驗中白藜蘆醇所使用的濃度均為10μM。
　　2、與對照組相比，Trauma組、Trauma+Res組以及Trauma+Res+WP1066組小鼠心功能在創(chuàng)傷后均存在不同程度的下降：①創(chuàng)傷后Trauma組、Trauma+Res組以及Trauma+Res+WP1066組回心血量均顯著減少，LVEDV分別較創(chuàng)傷前下降了44.6％（P<0.001）、25.6％（P=0.009）、39.3％（P<0.001

12、）；②在創(chuàng)傷刺激下，Trauma組、Trauma+Res組以及Trauma+Res+WP1066組心臟功能均出現(xiàn)了明顯的代償性改變，創(chuàng)傷后各組小鼠LVEF和LVFS分別較創(chuàng)傷前降低了14.7％（P<0.001）和25.3％（P<0.001）、9.4％（P=0.007）和15.8％（P=0.016）、12.3％（P=0.006）和23.7％（P=0.003）；③創(chuàng)傷后Trauma組、Trauma+Res組以及Trauma+Res+WP10

13、66組E/A比值和EDT較創(chuàng)傷前分別減少了36.3％(P=0.001)和28.8％（P=0.01）、25.6％（P=0.005）和20.9％（P=0.009）、32.5％(P=0.001)和27.3％（P=0.014）。
　　3、與對照組相比，Trauma、Trauma+Res和Trauma+Res+WP1066組小鼠的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加[(37.17±2.28)％vs(3.98±1.32)％，(8.72±1.59)％vs(

14、3.98±1.32)％，(28.93±1.95)％vs(3.98±1.32)％，P<0.01]，Caspase-3的活性進(jìn)一步增加（P<0.01）。
　　4、白藜蘆醇預(yù)處理可顯著減輕心肌應(yīng)激性損傷：①Trauma+Res組小鼠心功能在創(chuàng)傷后下降的幅度明顯低于Trauma及Trauma+Res+WP1066組（P=0.005）；②Trauma+Res組小鼠的LVEF值在創(chuàng)傷前后均顯著高于其他三組（P=0.007和P=0.008），而

15、其LVFS值在創(chuàng)傷前與其它組小鼠相比無顯著性差異（P=0.909），創(chuàng)傷后下降的幅度低于Trauma及Trauma+Res+WP1066組（P=0.048）；③創(chuàng)傷后Trauma+Res組小鼠E/A比值和EDT值下降幅度比Trauma及Trauma+Res+WP1066組要低，但無顯著性差異；④與Trauma和Trauma+Res+WP1066組相比，Trauma+Res組小鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低[(8.72±1.59)％vs(37

16、.17±2.28)％，(8.72±1.59)％vs(28.93±1.95)％，P<0.01]，Caspase-3的活性亦顯著降低（P<0.01）。
　　5、創(chuàng)傷可使心肌組織中STAT3表達(dá)增強（P<0.05vs.對照組），但STAT3磷酸化（p-STAT3表達(dá)）不明顯，Survivin表達(dá)也沒有明顯增強。
　　6、白藜蘆醇預(yù)處理可使創(chuàng)傷后小鼠心肌中STAT3的表達(dá)升高（P<0.05vs.對照組），同時可顯著增強STAT3的磷

17、酸化水平（P<0.001vs.對照組），Survivin的表達(dá)亦顯著增強（P<0.01vs.對照組）。
　　7、創(chuàng)傷前給予白藜蘆醇的同時給予WP1066（STAT3的抑制劑），小鼠心肌組織中STAT3表達(dá)、STAT3磷酸化水平（p-STAT3）及Survivin表達(dá)均明顯下降（P<0.05vs.Trauma+Res）。
　　結(jié)論：
　　1、非致死性創(chuàng)傷可導(dǎo)致小鼠心功能下降，小鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡，造成心臟應(yīng)激性損傷。