云南蘿芙木PNAE基因轉(zhuǎn)錄分析及原核表達(dá).pdf

1、云南蘿芙木(RauwoIfiayunnanensis Tsiang)因其含有多種功能的生物堿而被廣泛應(yīng)用于藥物提取。近年來隨著蘿芙木藥用價值的不斷開發(fā)，其資源被迅速消耗，再生速度遠(yuǎn)跟不上消耗速度。為了提高云南蘿芙木的資源利用率，研究其重要生物堿的代謝途徑大有必要。
　　在云南蘿芙木的藥用成分中，阿嗎靈(ajmaline)是其中一個重要的生物堿，聚精液素醛酯酶PNAE(polyneuridine aldehyde esterase)

2、則是阿嗎靈合成途經(jīng)中的關(guān)鍵酶。PNAE基因的表達(dá)調(diào)控模式可能與阿嗎靈的生成具有重要聯(lián)系。本論文在云南蘿芙木中對PNAE基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析，同時在體外進(jìn)行原核表達(dá)研究，為后期深入研究PNAE蛋白酶在阿嗎靈合成途徑中的功能奠定基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容如下:
　　1)云南蘿芙木外植體脫毒及組織培養(yǎng)條件研究。
　　2)PNAE基因克隆及序列分析。以云南蘿芙木成年植株葉片為原料提取RNA、反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR擴(kuò)增PNAE基因

3、片段。純化PCR產(chǎn)物之后進(jìn)行TA克隆，獲得795 bp擴(kuò)增片段。進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測PNAE蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)。分析結(jié)果表明該蛋白有265個氨基酸組成，αα螺旋、β轉(zhuǎn)角是該蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)中的主要元件，α螺旋散布于整個蛋白質(zhì)中，且該蛋白屬于親水性蛋白。
　　3)分析云南蘿芙木不同組織中PNAE基因的表達(dá)豐度。根據(jù)基因序列設(shè)計引物，選用18sRNA作為內(nèi)參基因，選取成年云南蘿芙木植株根、莖、老葉、嫩葉、花5個不同組織，組培幼苗根、莖

4、、葉3個組織部位分別作為樣本進(jìn)行相對定量分析，研究其在不同組織中的表達(dá)情況。比較數(shù)據(jù)出到結(jié)論:PNAE基因在成年植株各個組織部位中表達(dá)并無明顯差異，在組培幼苗中同樣無明顯差異。
　　4)PNAE酶的原核表達(dá)。構(gòu)建原核表達(dá)載體，對PNAE酶的原核表達(dá)條件進(jìn)行了初步探索。對培養(yǎng)基的成分、菌的種齡、菌液的接種量、搖瓶裝液量、振蕩器轉(zhuǎn)速、誘導(dǎo)劑IPTG濃度、誘導(dǎo)時機(jī)、誘導(dǎo)時間、培養(yǎng)與誘導(dǎo)溫度等進(jìn)行嘗試，獲得高效表達(dá)重組PNAE蛋白的誘導(dǎo)條