人牙本質(zhì)基質(zhì)材料復(fù)合人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于牙根再生的研究.pdf

1、研究背景：
　　各種原因造成的牙齒缺失是人類的常見疾病，對患者的咀嚼、發(fā)音、美觀甚至心理健康都等有顯著影響。而目前，針對牙齒缺失的修復(fù)方法有很多，但最接近真牙，經(jīng)久耐用的方法卻較少。種植牙作為修復(fù)牙齒缺失一種良好的方法，可以與牙槽骨較好的結(jié)合（骨結(jié)合），但種植牙缺乏一種重要的天然牙根結(jié)構(gòu)，即牙周組織。因此，牙齒再生已成為國際口腔醫(yī)學(xué)研究的熱點。然而，要再生一個完整的牙，需要突破很多科學(xué)難點，解決很多再生醫(yī)學(xué)共同的難題。
　　

2、近幾年有學(xué)者提出生物牙根的概念，即利用組織工程方法，用自然界存在的或人工合成的、且具有一定空間結(jié)構(gòu)的、有良好生物相容性的材料為載體，將一些具有成牙能力的細(xì)胞以特定方式“種植”到這種載體支架上，然后提供這些細(xì)胞增殖、生長和分化所需要的的生長因子微環(huán)境。通過細(xì)胞相互間的黏附、生長、增殖和分化，在體外或體內(nèi)形成具有一定牙周韌帶結(jié)構(gòu)的牙根。單純的牙根構(gòu)建不涉及調(diào)控牙冠的形態(tài)和大小，在牙齒組織工程研究中具有獨特的優(yōu)勢，如果能再生出一個具有牙周韌帶

3、結(jié)構(gòu)的生物牙根，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行樁冠修復(fù)，將有望成為一種理想的修復(fù)牙缺失的再生醫(yī)學(xué)治療方法。這種具有生物活性的且有一定天然牙根結(jié)構(gòu)的組織工程牙根有很大可能取代目前臨床上使用的種植義齒修復(fù)術(shù)。牙根再生是全牙再生的關(guān)鍵科學(xué)問題，牙根再生的實現(xiàn)對于臨床應(yīng)用具有重要的意義，可為牙冠構(gòu)建或全牙構(gòu)建提供新的研究策略。種子細(xì)胞、支架材料和誘導(dǎo)微環(huán)境是生物牙根構(gòu)建的核心部分。目前，已有學(xué)者利用組織工程技術(shù)，使用牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞和生物支架材料在體內(nèi)或者

4、體外成功的構(gòu)建了具有牙周膜、牙骨質(zhì)和牙槽骨的生物牙根。然而，在此構(gòu)建中應(yīng)用的種子細(xì)胞均為牙源性干細(xì)胞。雖然牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好的成牙分化能力，但實際臨床上該類細(xì)胞僅能通過拔除正常牙齒才能獲得，且獲得的數(shù)量有限，因此在臨床上獲取患者自體牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞受到一定限制。例如，對于無牙頜病人及全口牙缺失或者不愿拔出牙齒的患者，如何獲取到這些牙源性細(xì)胞，是一個有可能阻礙今后牙根再生在臨床上應(yīng)用的問題。在牙源性干細(xì)胞來源受到限制的情況下，探

5、索利用人體中已成功分離出的具有轉(zhuǎn)分化能力的多種成體干細(xì)胞進(jìn)行牙齒再生成為必然的選擇。如何誘導(dǎo)非牙源性干細(xì)胞牙向分化，建立效果明確且穩(wěn)定的誘導(dǎo)體系，是解決牙齒再生細(xì)胞來源問題的關(guān)鍵。來源于骨髓的間充質(zhì)細(xì)胞（英文全稱為BoneMarrowMesenchymalStemCells，簡稱BMMSCs）是一種具有較強(qiáng)增殖能力和多向誘導(dǎo)分化潛能的細(xì)胞，大量研究表明BMMSCs已被廣泛應(yīng)用于骨組織工程。除此之外，BMMSC具有分化成其他組織甚至其他胚

6、層細(xì)胞的可塑性，而且BMMSCs易于獲取，可以從患者自身獲得，避免了免疫排斥的問題。人牙本質(zhì)基質(zhì)材料（英文全稱為humanTreatedDentinMatrix，簡稱hTDM）已有研究證明是理想的牙組織工程的支架材料，人牙本質(zhì)基質(zhì)材料本身是一種細(xì)胞外基質(zhì)，對細(xì)胞沒有毒性，并且具有良好的生物學(xué)性能。同時hTDM含有利于成牙的生長因子，這樣為細(xì)胞的生長提供了一個良好的微環(huán)境，本研究在以上研究的基礎(chǔ)上，通過hTDM復(fù)合BMMSCs的體外及體內(nèi)

7、實驗，探究其BMMSCs的成牙能力。為組織工程方法實現(xiàn)牙根再生的研究提供依據(jù)。
　　目的：
　　在以上研究的基礎(chǔ)，本實驗利用改良的處理方法處理離體牙，從而得到新型人牙本質(zhì)基質(zhì)生物支架材料；在體外探究人牙本質(zhì)基質(zhì)材料對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長、增值分化等生物學(xué)特性的影響，并且通過體內(nèi)、體外實驗探究人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在人牙本質(zhì)基質(zhì)生物支架材料作用下，是否能夠進(jìn)行成牙方面的分化。為以后的牙根再生的研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　

8、材料和方法：
　　1.本實驗用骨髓從臨床進(jìn)行正頜外科手術(shù)修復(fù)頜面部畸形的患者取得，經(jīng)過患者同意后，于術(shù)中切取患者上下頜骨時收集剩余的骨組織。采用組織塊培養(yǎng)的方法，進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)。
　　2.本研究通過改良的梯度脫礦方法對人牙本質(zhì)基質(zhì)進(jìn)行處理后得到的TDM，掃描電鏡下牙本質(zhì)小管充分暴露，并且管間和管周牙本質(zhì)纖維組織變的十分疏松。
　　3.通過流式細(xì)胞術(shù)的方法對對本實驗細(xì)胞表面分子進(jìn)行鑒定。
　　4.利

9、用細(xì)胞免疫組化的方法對本實驗的細(xì)胞進(jìn)行來源鑒定。
　　5.通過成脂、成骨實驗，探究本實驗獲取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力
　　6.光鏡觀察TDM于骨髓間充后生物學(xué)特征的改變。
　　7.采用realtimePCR檢測經(jīng)過hTDM浸提液誘導(dǎo)之后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成牙基因的表達(dá)的情況。
　　8.hTDM復(fù)合BMMSCs移植到裸鼠皮下，體內(nèi)實驗探究TDM探究BMMSCs的成牙能力
　　結(jié)果：
　　1、采用組

10、織塊培養(yǎng)法將頜骨剪碎的骨塊接種培養(yǎng)瓶，96h后首次換液，一周后光學(xué)顯微鏡下可見頜骨組織塊周圍有細(xì)胞長出，絕大部分為梭形、多邊形。然后細(xì)胞逐漸增多。傳代后細(xì)胞的形態(tài)變得更加多樣化。
　　2、將收到的新鮮的離體牙制作與牙根相似外形的TDM，材料約有1mm厚，表面形態(tài)十分光滑而且規(guī)則。電鏡下可見牙本質(zhì)小管充分暴露，并且管間和管周牙本質(zhì)纖維組織變的十分疏松。
　　3、培養(yǎng)細(xì)胞制作細(xì)胞爬片，固定后采用Vimentin、CK14進(jìn)行免疫

11、組化染色，確定細(xì)胞來源。Vimentin染色成陽性、CK14染色成陰性
　　4、網(wǎng)，流式細(xì)胞儀上機(jī)，進(jìn)行細(xì)胞表面CD分子檢測。檢測指標(biāo)包括：CD105、D31、CD34、CD90、CD73、CD25、CD26、CD146、CD8b等。
　　5、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂、成骨實驗表明人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有較強(qiáng)的成脂成骨能力。
　　6、經(jīng)過hTDM作用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，TDM有利于細(xì)胞的生長，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目增加，細(xì)胞在材料

12、表面有良好的附著。
　　7、采用real-timePCR定量檢測TDM的浸提液誘導(dǎo)hBMSCs3、7天后，hBMSCs的成牙相關(guān)基因表達(dá)明顯增加。
　　8、hTDM復(fù)合BMMSCs移植到裸鼠皮下2個月后，發(fā)現(xiàn)TDM表面出現(xiàn)新生的牙本質(zhì)。
　　結(jié)論：
　　1.采用組織塊培養(yǎng)法能夠分離得到人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源于不表達(dá)上皮源性相關(guān)蛋白，表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞來源的相關(guān)標(biāo)志，并且表達(dá)干細(xì)胞特性