體外誘導(dǎo)人成體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分體外誘導(dǎo)人成體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化
　　目的：通過(guò)體外誘導(dǎo)的方法觀察人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外惡性轉(zhuǎn)化的可能。
　　方法：培養(yǎng)成體MSCs，通過(guò)GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)MSCs一個(gè)月以上，形成轉(zhuǎn)化后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(transformed mesenchymalcells，TMCs)。觀察TMCs的形態(tài)，測(cè)定TMCs和MSCs的生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期。流式細(xì)胞儀檢測(cè)TMCs和MSCs的表面標(biāo)志。并用wes

2、ternblot法檢測(cè)TMCs和MSCs端粒酶和c-myc的含量。
　　結(jié)果：用GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)后6～8w，MSCs有部分細(xì)胞轉(zhuǎn)化成TMCs，其形態(tài)具備了惡性腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)MSCs與TMCs表面標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)TMCs CD13和CD105的陽(yáng)性表達(dá)低于MSCs，而CD133和VEGFR2的陽(yáng)性表達(dá)高于MSCs。TMCs生長(zhǎng)速度比MSCs快，其S期細(xì)胞含量為41.1％，較MSCs(9.67％)明顯增加，表明

3、TMCs較MSCs有更強(qiáng)的增殖能力。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TMCs中端粒酶的含量是MSCs的16.7倍(t=15.00，p=0.0001)；TMCs c-myc的含量比MSCs增加了172.2％(t=10.58，P=0.0005)。
　　結(jié)論：MSCs體外培養(yǎng)時(shí)在GM-CSF和IL-4作用下可以發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。
　　第二部分轉(zhuǎn)化后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　目的：通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)化后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

4、(TMCs)能否在動(dòng)物體內(nèi)形成腫瘤，從而驗(yàn)證MSCs發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化。
　　方法：經(jīng)尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)：45只NOD/SCID小鼠分3組，每組15只，分別為TMCs組，MSCs對(duì)照組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和MSCs對(duì)照組分別將2.5×105cells/ml的細(xì)胞懸液200μl經(jīng)尾靜脈注射至NOD/SCID小鼠體內(nèi)，空白組注射200μl PBS。在第3、7、14、21和25d每組分別處死裸小鼠各3只。取出肺臟，稱重，并計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。將肺臟標(biāo)

5、本切片行HE染色和免疫組化檢查。
　　經(jīng)皮下注射實(shí)驗(yàn)：將18只6周齡雄性BALB/C-nu裸小鼠分為TMCs組、MSCs對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組和MSCs對(duì)照組分別將2.5×105cells/ml的細(xì)胞懸液200μl注射至6周齡BALB/C裸小鼠前臂內(nèi)側(cè)皮下，空白對(duì)照組注射200μl PBS。第25d處死小鼠，取出皮下腫瘤病灶測(cè)量大小并稱重。腫瘤標(biāo)本切片行HE染色和免疫組化檢查。
　　結(jié)果：尾靜脈注射時(shí)發(fā)現(xiàn)第7d

6、 TMCs組開(kāi)始出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，第14d開(kāi)始所有裸鼠均發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移。MSCs對(duì)照組和空白對(duì)照組均沒(méi)有轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)形成。TMCs和MSCs兩組裸鼠在3、7、14d時(shí)鼠肺濕重差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而21d、25d時(shí)TMCs組鼠肺濕重明顯增加。HE染色腫瘤細(xì)胞排列紊亂，核大小、形狀和染色不一，并可見(jiàn)多核、異型核等，具備了惡性腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。免疫組化結(jié)果肺部轉(zhuǎn)移灶中鼠肺細(xì)胞的CD133陽(yáng)性率明顯增加。皮下注射組所有TMCs組12～16d均在裸鼠皮下

7、形成腫瘤，體積為3.02士0.83cm3，重量1.37±0.16g；而對(duì)照組均未形成腫瘤結(jié)節(jié)。皮下腫瘤組織免疫組化結(jié)果顯示VIM(+)，DES(+)，SMA(+)，CD133(+)，CD34(+)，S100(+)，NSE(-)，PA-CK(-)，EMA(-)，DFAP(-)，提示腫瘤可能為橫紋肌來(lái)源惡性腫瘤，同時(shí)顯示TMCs具有干細(xì)胞特性，能向不同種類細(xì)胞分化。
　　結(jié)論：TMCs為惡性腫瘤細(xì)胞，無(wú)論通過(guò)尾靜脈注射或皮下種植均能在

8、裸鼠體內(nèi)形成腫瘤。MSCs不能在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤。
　　第三部分siRNA抑制hTERT基因表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)化后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響
　　目的：探討小干擾RNA(siRNA)抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerase reverse transcriptase，hTERT)表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)化后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(TMCs)增殖和在動(dòng)物體內(nèi)成瘤能力的影響。
　　方法：構(gòu)建針對(duì)人hTERT的siRNA，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將hTE

9、RT-siRNA轉(zhuǎn)染TMCs。實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)濃度組，分別為50nmol/L，100nmol/L和200nmol/L，設(shè)陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。用MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)siRNA對(duì)TMCs生長(zhǎng)增殖和凋亡的影響。用westernblot檢測(cè)各濃度組TMCs的端粒酶蛋白的含量。RT-PCR各濃度組hTERT mRNA的含量，并用TRAP-ELISA法檢測(cè)各濃度組TMCs端粒酶的活性。通過(guò)BALA/C裸鼠檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后各組TMCs在動(dòng)物體

10、內(nèi)成瘤能力的變化。
　　結(jié)果：通過(guò)western blot，我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的hTERT-siRNA組TMCs的端粒酶蛋白含量逐漸減少，與siRNA的濃度呈負(fù)相關(guān)，50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L組分別下降了46.2％，69.5％和91.5％；MTT法檢測(cè)3個(gè)濃度組hTERT-siRNA對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為2.74％、7.26％和10.23％。其中50nmol/L組和對(duì)照組之間差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而10

11、0nmol/L組和200nmol/L組與陰性對(duì)照組之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞儀檢測(cè)50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L hTERT-siRNA轉(zhuǎn)染組的TMCs凋亡率分別為：5.12％，6.67％和8.04％，各組和對(duì)照組相比差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L hTERT-siRNA轉(zhuǎn)染組hTERT基因分別下降了19.2％，47.2％，86.4％。T

12、RAP-ELISA法檢查發(fā)現(xiàn)，不同濃度的hTERT-siRNA對(duì)TMCs的端粒酶活性都產(chǎn)生抑制作用，3組分別下降了11.0％，42.9％，86.2％。100nmol/L組和對(duì)照組TMCs在裸鼠皮下形成腫瘤的時(shí)間相似，分別為14.8d和14.2d；200nmol/L組成瘤時(shí)間較晚，為17.3d。對(duì)照組形成的皮下腫瘤體積和重量分別為2.56cm3和1.30g，而100nmol/L和200nmol/L組腫瘤體積分別為0.64cm3和0.31c