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文檔簡介
1、背景:
結(jié)直腸癌(CRC)是最常發(fā)生的消化道惡性疾病之一,其發(fā)生率和死亡率呈逐年升高的趨勢,嚴重威脅著人類的健康。結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展與腸道炎性疾病關(guān)系密切,炎性疾病在刺激因素的作用下反復發(fā)生,遷延不愈,產(chǎn)生的慢性非特異性潰瘍性結(jié)直腸炎伴上皮內(nèi)瘤變是結(jié)直腸癌發(fā)生的病理學基礎(chǔ),進而由低級別上皮內(nèi)瘤變向高等級上皮內(nèi)瘤變序列演進,最終演化為結(jié)腸癌。其中表觀遺傳學的異常在結(jié)腸癌的發(fā)生進程中起著重要作用,DNA甲基化異常及microRNA
2、含量變化是其中最重要的因素,圍繞這兩個因素深入研究有利于有效地早期預警、干預結(jié)腸癌發(fā)生,是臨床早期診斷、早期治療結(jié)腸癌的關(guān)鍵。
生物體內(nèi)有著多種基因調(diào)控的方式,包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯前調(diào)控、翻譯后調(diào)控和表觀遺傳學調(diào)控等,其中結(jié)直腸癌有關(guān)的癌基因和抑癌基因的異常調(diào)控與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系緊密。DNA甲基化與羥甲基化作為表觀遺傳學修飾及microRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控互相關(guān)聯(lián),在基因調(diào)控方面發(fā)揮重要作用,與細胞多個功能的
3、維持及結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密不可分。
5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)是由TET(ten-eleven translocation)家族酶氧化5-甲基胞嘧啶(5-mC)產(chǎn)生,其不但干預了DNA主動去甲基化過程,還對基因的表達具有雙重調(diào)節(jié)作用。有大量文獻報道,對比于癌旁組織,5-hmC在腫瘤中含量明顯減低。5-hmC在肝癌和結(jié)直腸癌等實體瘤中表達含量降低也已得到證實,其發(fā)生的可能原因是在腫瘤組織中TET酶的表達水平降低。但TET家
4、族蛋白及5-hmC含量在結(jié)腸炎及結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的表達情況尚不清楚,其作用及調(diào)控機制尚未完全闡明。本項目擬通過檢測TET家族蛋白及5-hmC在結(jié)腸炎及結(jié)腸癌中的表達,探索其與結(jié)腸炎及結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性,為5-hmC作為消化系腫瘤表觀遺傳學標志物找尋新證據(jù)。
microRNA是一組長度約為19-24個核苷酸組成的非編碼的小分子RNA,可以靶向結(jié)合特定mRNA引起其降解,抑制蛋白質(zhì)的翻譯,進而對腫瘤有關(guān)基因的表達發(fā)揮重要
5、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用,影響細胞遷移、增殖、分化和凋亡,起著類癌或抑癌基因的功能。通過對結(jié)直腸癌及癌旁組織進行高通量測序的方法篩選得到在結(jié)直腸癌中含量明顯升高的microRNA分子:miR-647和miR-1914,其均定位于人染色體20q13,相距約1086bp,深入探索發(fā)現(xiàn)其作為一個microRNA簇通過促進結(jié)直腸癌細胞增殖及遷移,參與結(jié)直腸癌的啟動。
目的:
1.檢測TET蛋白家族及5-hmC在結(jié)直腸炎及結(jié)直腸癌中的表
6、達,并闡明其與結(jié)直腸炎及結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性;
2.檢測miR-647及miR-1914在結(jié)直腸癌及細胞中的含量,并闡明其在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中的功能及其調(diào)控機制。
方法:利用免疫組化及免疫熒光實驗明確5-hmC在結(jié)腸炎及結(jié)直腸癌中的含量;利用qPCR技術(shù)明確 TET蛋白家族在結(jié)腸炎及結(jié)直腸癌中的水平情況,探索二者之間的相關(guān)關(guān)系;利用生物信息學高通量測序技術(shù)結(jié)合RNA-seq的分析方法檢測結(jié)直腸癌與癌旁在轉(zhuǎn)
7、錄水平TET蛋白家族及microRNA分子含量變化情況,篩選出表達差異最明顯的 microRNA分子;利用 qPCR技術(shù)對22對結(jié)直腸癌患者癌及癌旁組織中miR-647及miR-1914的含量進行測試;利用qPCR技術(shù)檢測人腸上皮細胞HIEC及結(jié)腸癌細胞HT-29中miR-647及miR-1914的水平;將miR-647及miR-1914的模擬物mimics或抑制劑antagomir及對照分別轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細胞或正常人腸上皮細胞中,使用M
8、TT實驗方法檢測細胞增殖的能力,用transwell實驗方法和體外劃痕實驗方法檢測細胞遷移的水平,評價miR-647及miR-1914對結(jié)腸癌細胞的增殖能力和遷移能力的影響;分析miR-647和miR-1914在結(jié)直腸癌細胞對5-FU的敏感性中發(fā)揮的功效;應用生物信息學方法分析與i-TRAQ同位素標記相對和絕對定量實驗技術(shù)相結(jié)合的方法篩選和鑒定miR-647和miR-1914的靶基因,最后經(jīng)熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蛁PCR實驗對靶基因進行
9、驗證;通過小分子調(diào)節(jié)劑干預靶基因在結(jié)腸癌中的表達,探究和討論靶基因在結(jié)直腸癌啟動中的作用。
結(jié)果:
1.免疫組化及免疫熒光結(jié)果顯示5-hmC在結(jié)直腸癌中表達含量下降,在結(jié)腸炎中5-hmC表達含量上升;
2.通過IL-6干預HIEC及結(jié)直腸癌細胞構(gòu)建炎癥模型,通過免疫組化和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)結(jié)腸細胞炎癥狀態(tài)時,5-hmC含量升高,其升高與TET蛋白的升高有關(guān),TET1和TET2在其中發(fā)揮了重要作用;
10、3.通過DSS刺激小鼠構(gòu)建小鼠腸道急性炎癥模型和小鼠腸道慢性炎癥模型,通過免疫組化和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸炎癥狀態(tài)時,5-hmC含量升高,其升高與TET蛋白的升高有關(guān),TET1和TET2在其中發(fā)揮了重要作用;
4.轉(zhuǎn)錄本結(jié)果表示,與癌旁組織相比,在結(jié)直腸癌中TET含量下降,但無統(tǒng)計學差異;
5.轉(zhuǎn)錄本結(jié)果顯示miR-647及miR-1914在結(jié)直腸癌中增高最明顯,與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān),其靶基因NFIX在結(jié)
11、直腸癌中也表達含量異常;
6.qPCR結(jié)果顯示miR-647和miR-1914在人結(jié)直腸癌組織標本及細胞系中均表達水平提高;
7.MTT實驗結(jié)果顯示miR-647和miR-1914可以促進結(jié)腸癌細胞增殖;
8.劃痕試驗和transwell試驗結(jié)果證明miR-647和miR-1914可以促進結(jié)直腸癌細胞遷移;
9.增殖實驗顯示miR-647和miR-1914聯(lián)合促進結(jié)腸癌細胞對5-FU的敏感性;
12、r> 10.i-TRAQ實驗及靶基因預測軟件預測NFIX是miR-647的靶基因;熒光素酶報告基因?qū)嶒灱皅PCR實驗證明NFIX是miR-647和miR-1914的共同靶基因;
11.小分子調(diào)節(jié)劑的引入及功能實驗證明miR-647聯(lián)合miR-1914通過下調(diào)NFIX的表達增進結(jié)直腸癌細胞的增殖和遷移,參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。
結(jié)論:
1.5-hmC在結(jié)直腸癌中表達下降,在結(jié)腸炎癥狀態(tài)時表達升高,TET1及
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