IL-17A在結腸炎相關結直腸癌變中的作用與機制研究.pdf

1、結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，是整個世界范圍內(nèi)造成死亡的主要疾病之一，在歐美國家分別位列第一、二位，發(fā)病率呈逐年增長趨勢。據(jù)美國癌癥協(xié)會估計，2014年美國新發(fā)CRC病例136830例，死亡50310例。近年來，我國結直腸癌特別是直腸癌(占60％)的發(fā)病率和病死率也呈不斷上升趨勢，CRC的發(fā)病率在我國城市和農(nóng)村分別占惡性腫瘤發(fā)病率的第四位和第六位，嚴重威脅國民的身心健康。潰瘍性結腸炎相

2、關結直腸癌是潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis, UC）的嚴重并發(fā)癥，雖然只占所有CRC的1%～2%，但死亡率卻占UC患者的10%～15%。
　　結直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多因素、多階段的過程。研究表明某些因素能夠增加患結直腸癌的風險，如年齡、結直腸息肉、潰瘍性結腸炎和克羅恩病、結直腸癌家族史、種族、2型糖尿病等，家族性腺瘤息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)或遺傳

3、性非息肉病性大腸癌(hereditary nonpolyposis colon cancer, HNPCC)等家庭綜合癥。一些生活習慣因素也與高結腸直腸癌的風險有關，如膳食中含大量紅肉類（牛肉、羊肉、或肝臟）、加工肉類（如熱狗和博洛尼亞）及高熱量食品，缺乏鍛煉、超重和肥胖、吸煙、酗酒等。眾所周知，炎癥性腸病(Inflammatory bowel diseases, IBD)，包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病，有發(fā)展成為結直腸癌的風險，目前普遍

4、認為，IBD是攜帶遺傳易感基因的宿主在環(huán)境因素參與下，由于慢性腸道感染、黏膜抗原屏障缺陷以及腸腔內(nèi)抗原物質(zhì)的異常免疫反應所導致。長期UC患者發(fā)生癌變的危險性升高，UC并發(fā)結直腸癌癌變可能與其慢性炎癥長期作用相關，其發(fā)生發(fā)展經(jīng)歷著從正常上皮組織、低度異型增生、高度異型增生到癌變的過程，但目前具體機制仍不明，多方面因素改變均可能在癌變過程中發(fā)揮重要作用。
　　白細胞介素17(Interleukin-17, IL-17)是體內(nèi)重要的促炎

5、癥細胞因子，由155～197個氨基酸構成，分子量約為20～30kDa，主要由活化的T淋巴細胞分泌，包括CD4+CD45RO+T細胞、CD8+T細胞、γδT細胞等，其中，CD4+T細胞亞群中Th17細胞是IL-17的主要來源細胞，但最近研究發(fā)現(xiàn)上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞以及某些腫瘤細胞均可產(chǎn)生 IL-17。IL-17家族以同源或異源二聚體的形式行使功能，IL-17與IL-17RA/IL-17RC異源二聚體形成復合體，通過類似于纖維母細胞因子的

6、表達方式，激活核因子-κB（NF-κB）激活劑1（nuclear factor-κB activator1, Act1)、IL-17受體和 Toll-IL-1R（SEFIR)受體結構域。Act1是一種 E3泛素連接酶，通過Ubc13/Uev1A E2復合物，以K63多聚泛素化的方式在K124位修飾腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor6, TRAF6)

7、，介導IL-17下游信號傳遞及炎癥基因表達。多聚泛素化的TRAF6激活轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1(transforming growth factor-β- activated kinase1, TAK1)和IκB激酶(IκB kinase, IKK)復合物，后者激活NF-κB信號通路，啟動包括 CXCL1、IL-6、VEGF等的一系列化學因子、細胞因子和生長因子的轉(zhuǎn)錄。IL-17只能微弱激活下游信號及基因表達，但IL-17可以調(diào)控 mR

8、NA穩(wěn)定性，以此協(xié)同其他細胞因子，從而放大靶細胞對IL-17的反應。IL-17能夠通過IKKi激酶依賴的Act1-TRAF2- TRAF5復合體，增加下游CXCL1mRNA穩(wěn)定性，Act1-TRAF2-TRAF5復合體與剪接子2(splicing factor2, SF2)綁定，阻止SF2/ASF介導的mRNA降解。目前，IL-17在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚存在爭議，利用動物模型，一些研究發(fā)現(xiàn)IL-17A可以通過IFN-γ生產(chǎn)NK細胞和T

9、細胞，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，而另有研究表明，IL-17A能夠通過IL-6/Stat3信號途徑或通過誘導腫瘤局部微環(huán)境改變，促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。
　　本研究旨在探討IL-17A在結腸炎相關結直腸癌發(fā)生中的作用，并對其機制進行初步探討，為治療結腸炎相關結直腸癌提供理論依據(jù)。
　　第一部分人結腸組織癌變與IL-17A誘導的炎癥反應增強有關
　　目的：探討IL-17A誘導的炎癥反應在人結腸癌中的作用。
　　方法：通過

10、ELISA方法檢測結腸組織中 IL-17A細胞因子濃度， Western blot方法檢測IL-17/IL-17R、VEGF、MMP2、MMP7、MMP9、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白，免疫組織化學染色方法檢測 IL-17、MMP2蛋白在結腸組織中的定位，利用CD34染色檢測結腸組織中微血管密度。
　　結果：IL-17A和IL-17RA蛋白均為結直腸癌組織中最高，明顯高于腺瘤、潰瘍性結腸炎及正常結腸組織。伴隨 IL-

11、17A和 IL-17RA增加， IL-17A誘導的炎癥反應增強，包括細胞外信號轉(zhuǎn)導信號 ERK1/2和JNK激活、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9、MMP7和MMP2、Bcl-2和CyclinD1表達增加，Bax表達減少。結直腸癌組織中VEGF和VEGFR表達最高，其次為腺瘤組織，而在潰瘍性結腸炎組織和正常結腸組織中的 VEGF蛋白幾乎檢測不到。
　　第二部分 IL-17A對HCT116細胞遷移侵襲能力的影響
　　目的：探討IL-17

12、A對結直腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　方法：體外培養(yǎng)HCT116細胞，經(jīng)過不同的處理（空白對照組、IL-17A處理組、PD98059+IL-17A組、SP600125+IL-17A組），分別采用劃痕實驗和Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力， Western blot方法檢測IL-17RA、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、MMP2、MMP7、MMP9、CyclinD1、Bcl-2、Bax、VEGF、VEGFR蛋

13、白表達。
　　結果：臺盼藍染色及細胞藍?檢測均顯示IL-17A處理的HCT116細胞增殖活性高于對照組，而PD98059和SP600125預處理組細胞增殖活性顯著下降；對照組、IL-17A組、PD98059和SP600125預處理組Transwell穿膜細胞數(shù)為9.5±1.06、15.4±1.11、3.7±0.53和4.3±0.55，除后2組之間差異無統(tǒng)計學意義外，其余各組間差異均有統(tǒng)計學意義；IL-17A組HCT116細胞遷移能

14、力最強，劃痕變窄，而PD98059和SP600125預處理組細胞遷移能力下降，劃痕距離未見明顯變化；IL-17A增加HCT116細胞IL-17RA、MMP2、MMP7、MMP9、CyclinD1、Bcl-2、VEGF、VEGFR蛋白分泌，使ERK1/2、JNK磷酸化增加，給予PD98059和SP600125預處理，上述蛋白表達減少。
　　第三部分 IL-17A siRNA對結腸炎相關結直腸癌模型小鼠的治療作用
　　目的：探討

15、IL-17A siRNA對結腸炎相關結直腸癌模型小鼠的治療作用。
　　方法：采用偶氮氧化甲烷/葡聚糖硫酸鈉方法建立潰瘍性結腸炎相關結直腸癌小鼠模型，建模成功后給予IL-17A siRNA干擾治療，實驗分為對照組、模型組和IL-17A siRNA治療組，Real-time PCR檢測各組結腸組織IL-17A、IL-17ramRNA水平，Western blot檢測IL-17A、IL-17RA、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、

16、MMP2、MMP7、MMP9、CyclinD1、Bcl-2、Bax、VEGF、VEGFR蛋白表達。
　　結果：IL-17A siRNA治療組小鼠體重較模型組增加，粘膜上皮損傷及腺體結構的消失程度均較模型組減輕；IL-17A和IL-17RA基因和蛋白均為模型組最高，IL-17A siRNA治療組次之，對照組最低（P<0.05）；IL-17A siRNA治療組p-ERK1/2、p-JNK蛋白低于模型組；模型組、IL-17A siRNA

17、治療組、對照組結腸組織中MMP2、MMP7、MMP9、Bcl-2、Cyclin D1、VEGF、VEGFR蛋白表達依次降低，而Bax則為對照組最高，模型組最低。
　　結論：
　　1結直腸癌組織中IL-17A表達增高。
　　2 IL-17A可能通過ERK1/2和JNK1/2信號通路調(diào)控下游信號蛋白表達，在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。
　　3 IL-17A siRNA治療能夠抑制結直腸癌進展，可能成為結直腸癌預防和治