黃芪多糖通過干預CLP小鼠DC細胞對膿毒癥的影響及機制研究.pdf

1、膿毒癥即機體在遭受外界打擊時引起的全身炎癥反應，膿毒癥發(fā)病過程就是一個免疫紊亂過程，早期主要表現(xiàn)為免疫過度，后期出現(xiàn)免疫抑制。在膿毒癥期間樹突狀細胞功能和分泌都是受到抑制的，激活或者恢復樹突狀細胞的活性，能夠很好地改善膿毒癥癥狀，因此我們可以將DC細胞作為治療膿毒癥的一個作用靶點，沿著這個思路，我們只需要尋找出一種能夠活化DC細胞的藥物是不是就可以達到治療膿毒癥的目的？
　　我國藥典中規(guī)定，中藥黃芪取自蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，

2、主要在我國的東北和華北地區(qū)分布，被廣泛應用于傳統(tǒng)中醫(yī)藥學。近年來研究已經發(fā)現(xiàn)黃芪有很多生物活性成分，如多糖、皂苷、黃酮等，其中以易得、便宜，成熟提取技術和明確的有效成分的黃芩多糖（APS）的研究為多。大量的科學實驗證明APS對機體體液免疫與細胞免疫有著廣泛的影響，并能夠調節(jié)細胞因子的分泌。我們實驗室前期已經探討了發(fā)現(xiàn)APS能夠活化正常小鼠脾的DC，因此我們嘗試著將黃芪多糖（APS）作為靶點藥物，探討APS對膿毒癥時DC的作用關系，并為黃

3、芪多糖以DC為作用靶點治療膿毒癥提供臨床依據。
　　鑒于此，我們將本研究分為兩個部分探討：
　　第一部分，在體實驗中初步探討APS干預CLP小鼠脾中的DC后，DC的數(shù)量、表型以及體內相關炎癥因子的變化情況；
　　第二部分，體外實驗進一步明確APS如何對DC產生作用，從而達到對膿毒癥小鼠有保護作用，通過細胞回輸，將理論結合應用，為APS以DC作為靶點治療膿毒癥提供依據。
　　第一部分在體實驗中初步探討APS對CLP

4、小鼠的DC亞群的影響
　　方法：
　　1、造模及分組，60只C57BL/6、SPF級健康雄性小鼠，應用盲腸結扎穿孔（CLP）制備成CLP膿毒模型鼠，分為四組（CLP、APS-50mg/g、APS-100mg/g、APS-200mg/g）。另取20只C57BL/6、SPF級健康雄性小鼠，應用盲腸結扎穿孔（CLP）制備成CLP膿毒模型鼠，分為四組（CLP、DC-105、DC-5x105、DC-106）。
　　2、獲取細胞：

5、免疫磁珠法分離純化小鼠脾的DC，50mg/g、100mg/g、200mg/g的APS體外注射到CLP小鼠腹腔，之后分別在1d、2d、3d、5d獲取脾的DC細胞（CLP造模當天記為0d）。
　　3、觀察死亡率：CLP造模后第1d時在DC組小鼠分別腹腔注入105、5x105、106個DC細胞，對照組CLP注入生理鹽水，分別在第1d、2d、3d、5d觀察小鼠死亡情況。
　　4、采用酶聯(lián)吸附試驗（ELISA）檢測IL-10、IL-1

6、2、IL-6、TNF-α細胞因子表達。
　　5、熒光染色:經CD11c-APC，CD45RB-PE抗體染色得到DC兩細胞亞群，DC標染CD40、CD80、CD86、I-A\E得到其表面分子表達情況。
　　6、流式細胞術：（5）中標染后抗體通過流式細胞儀表達，以及通過流式評估DC細胞數(shù)量的變化。
　　7、統(tǒng)計學方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用xs表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.

7、05代表差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、在體實驗中，正常DC注射到CLP小鼠可以提高其生存力，說明DC先天具有對CLP小鼠的保護作用；
　　2、APS注射到CLP小鼠體內后，DC表面分子（CD40、CD80、I-A\E）與未經處理的DC表面分子表達明顯增高，APS干預可以對DC表型分子表達增加。
　　3、APS注射到CLP小鼠體內后得到脾的DC，DC數(shù)量與未經處理的明顯增加，且對CD11chigh DCs

8、的影響呈劑量劑量依賴關系，而對CD45chigh DCs的影響呈有增有降的不穩(wěn)定趨勢；
　　4、從APS注射的CLP小鼠體內脾的DC細胞上清中獲取的IL-12、IL-10檢測，發(fā)現(xiàn)CD11chigh DCs分泌的IL-12與APS呈劑量依賴關系，而與CD45chigh DCs分泌的IL-10呈負相關關系；
　　5、從APS注射的CLP小鼠體內脾的DC細胞上清中獲取的IL-6、TNF-γ檢測，發(fā)APS對CLP模型小鼠炎癥早期無

9、明顯影響，而很明顯地降低了后期炎癥因子的釋放。
　　結論:
　　在在體實驗中初步發(fā)現(xiàn)APS能夠影響DC的功能和表型，并且可能主要在膿毒癥后期免疫抑制中發(fā)揮作用。
　　第二部分體外實驗進一步明確APS如何對DC亞群分化產生作用，體內細胞回輸明確APS對機體的保護作用
　　方法：
　　1、模型鼠:20只C57BL/6、SPF級健康雄性小鼠，應用盲腸結扎穿孔（CLP）制備成CLP膿毒模型鼠，分為四組（CLP、AP

10、S-50ug/ml、APS-100ug/ml、APS-200ug/ml），造模當天記為0d；
　　2、細胞培養(yǎng)：CD11chighDCs、CD45chighDCs各自獨立培養(yǎng)；CD11chighDCs、CD45chighDCs分別與CD4+T細胞混合培養(yǎng)；APS-50ug/ml、APS-100ug/ml、APS-200ug/ml與正常DC干預2h培養(yǎng)；
　　3、采用酶聯(lián)吸附試驗（ELISA）檢測小鼠眼底血或者上清中IL-10

11、、IL-12、IL-4、TNF-γ細胞因子的表達；
　　4、流式細胞術：分析CD11chigh DCs、CD45chigh DCs分別被APS刺激后的數(shù)量統(tǒng)計；
　　5、細胞回輸：分別取出105個APS刺激2h的DC體外腹腔注入CLP第1d時的小鼠體內，在第1d、2d、3d、5d觀察小鼠死亡情況，并作記錄；
　　6、統(tǒng)計學方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用i±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方

12、差分析，P<0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、APS（50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml）刺激分別DC兩亞群，得到的DC數(shù)量圖和細胞因子圖發(fā)現(xiàn)APS刺激后CD11chighCD45RblowDCs的數(shù)量及IL-12的分泌都增加，并呈明顯劑量關系而對CD11clowCD45RbhighDCs及IL-10的分泌無明顯影響。初步說明APS對DC細胞的影響主要是影響CD11chigh DCs以及IL

13、-12的分泌。
　　2、APS（50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml）刺激的CD11chigh DCs和CD45chigh DCs分別于CD4+T細胞混合培養(yǎng)體系中檢測CD4+T細胞的相關細胞因子（IL-4、IFN-γ）檢測，表明APS可以更進一步活化T淋巴細胞功能，進而使Th2向Th1反應轉移。
　　3、經APS刺激后的DC回輸?shù)紺LP小鼠體內后，CLP模型小鼠的生存力得到明顯的提高，與前面未經APS刺激的D

14、C，回輸?shù)叫∈篌w內后亦有明顯提高趨勢，初步說明通過體外對DC的功能干預，再回輸?shù)襟w內對膿毒癥有保護作用。
　　結論：
　　體外實驗進一步明確APS如何干預DC：誘導小鼠脾的樹突狀細胞向產IL-12的CD11chighCD45RBlow DC亞群分化，并且APS進一步活化T淋巴細胞功能，進而使Th2向Th1反應轉移。此外，APS對T淋巴細胞向Th1分化與IL-10產生的CD11clowCD45RBhigh DC亞群無明顯影響。