長鏈非編碼RNa-LINC00628在胃癌中的表達(dá)及其腫瘤生物學(xué)功能研究.pdf

1、[目的]篩選并鑒定胃癌相關(guān)長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA);觀察目標(biāo)LncRNA在胃癌腫瘤組織中異常表達(dá)的臨床意義及與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系;研究目標(biāo)LncRNA對于胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響;初步探索目標(biāo)LncRNA在胃癌中發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)制及其下游調(diào)控靶點，以期為胃癌的分子診斷和臨床治療尋找新的靶點和思路，并提供相應(yīng)的理論和實驗依據(jù)。
　　[方法]1）收集2009年10月至2009年12

2、月間上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院普外科收治并行手術(shù)切除的5對胃癌患者腫瘤及癌旁正常組織新鮮標(biāo)本，應(yīng)用LncRNAs/mRNA基因芯片初步篩選胃癌中異常表達(dá)LncRNA;收集2010年1月至2010年8月間上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院普外科收治并接受手術(shù)治療的39例胃癌患者腫瘤及配對癌旁正常組織新鮮標(biāo)本，通過Realtime PCR方法對候選LncRNAs進(jìn)行驗證;2）收集2007年1月至2010年12月間上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)

3、院普外科收治并接受手術(shù)治療的82例胃癌患者腫瘤組織新鮮標(biāo)本，通過Realtime PCR檢測目標(biāo)LncRNA表達(dá)水平，分析其與胃癌患者臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系;3）通過慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的目標(biāo)LncRNA干擾、過表達(dá)胃癌細(xì)胞系，并通過細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、遷移、侵襲等體外細(xì)胞功能實驗及裸鼠皮下成瘤實驗研究目標(biāo)LncRNA對于胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響;4）通過Realtime PCR、western bolt檢測研究目標(biāo)LncR

4、NA對鄰近編碼蛋白基因的調(diào)控作用;5)通過表達(dá)譜基因芯片、Realtime PCR、western bolt檢測尋找目標(biāo)LncRNA下游直接或間接調(diào)控基因及相關(guān)信號通路。
　　[結(jié)果]1）LncRNA-LINC00628在胃癌腫瘤組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(2-△Ct，0.123 vs.0.041;P=0.027);其上游248KB處的編碼蛋白基因LRRN2在胃癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織，差異

5、具有統(tǒng)計學(xué)意義（2-△ Ct，0.148 vs.0.046;P=0.035）。2）胃癌組織中LINC00628的表達(dá)水平與腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移及神經(jīng)侵犯密切相關(guān)。LINC00628高表達(dá)組患者腫瘤位于胃竇部的比例顯著高于低表達(dá)組(80.5％ vs.46.3％，P=0.010);高表達(dá)組腫瘤長徑≤5cm患者比例顯著高于低表達(dá)組(56.1％vs.19.5％，P=0.001);高表達(dá)組腫瘤浸潤深度達(dá)到漿膜層患者比例顯著低于低

6、表達(dá)組(78.1％ vs.97.6％，P=0.050);高表達(dá)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量≥7個的患者比例顯著低于低表達(dá)組(26.8％ vs.48.8％，P=0.047);高表達(dá)組患者出現(xiàn)神經(jīng)侵犯的比例顯著低于低表達(dá)組(9.8％ vs.39.0％，P=0.004)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示LINC00628表達(dá)與胃癌患者預(yù)后密切相關(guān)，LINC00628高表達(dá)患者5年總生存率顯著高于低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(56.7％ vs.33

7、.4％,P=0.039)。但多因素分析顯示LINC00628并不是影響胃癌患者預(yù)后的獨立預(yù)后因素(OShazard ratio:1.362，P=0.394)。3）在7株胃癌細(xì)胞系中選擇LncRNA-LINC00628表達(dá)量最高的SGC-7901和AGS細(xì)胞系，以及表達(dá)量最低的MGC-803和HGC-27細(xì)胞系，通過慢病毒轉(zhuǎn)染分別構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的干擾及過表達(dá)胃癌細(xì)胞。干擾、過表達(dá)效率驗證結(jié)果:在sh-1片段干擾的SGC-7901和AGS胃癌

8、細(xì)胞中LINC00628表達(dá)量分別較對照組細(xì)胞下調(diào)79.4％和71.2％;在過表達(dá)的HGC-27和MGC-803細(xì)胞中LINC00628的表達(dá)量分別較對照組細(xì)胞上調(diào)7189倍和868倍。CCK-8實驗顯示:干擾LINC00628后SGC-7901和AGS胃癌細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)，而過表達(dá)LINC00628的MGC-803和HGC-27細(xì)胞增殖能力顯著下降。平板集落形成實驗結(jié)果顯示:干擾LINC00628的SGC-7901細(xì)胞集落形成率

9、(6.2％，186/3000)顯著高于對照組細(xì)胞(1.87％，56/3000)，而過表達(dá)LINC00628的MGC-803細(xì)胞集落形成率(0.9％，9/1000)則顯著低于對照組細(xì)胞(2.5％，25/1000)。Transwell遷移實驗結(jié)果顯示:干擾LINC00628后的SGC-7901和AGS胃癌細(xì)胞穿透小室的細(xì)胞數(shù)量較對照組均顯著增加（SGC-7901:102.2±10.4個/高倍鏡視野vs.28.6±2.3個/高倍鏡視野;AGS

10、:25.0±1.8個/高倍鏡視野vs.13.2±1.2個/高倍鏡視野），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);過表達(dá)LINC00628的HGC-27和MGC-803胃癌細(xì)胞穿透小室的細(xì)胞數(shù)量較對照組顯著減少(HGC-27:56.2±7.8個/高倍鏡視野vs.106.8±6.5個/高倍鏡視野;MGC-803:28.2±2.2個/高倍鏡視野vs.74.4±6.2個/高倍鏡視野），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Transwell膠穿實驗結(jié)果

11、顯示:干擾LINC00628的SGC-7901細(xì)胞與對照組細(xì)胞穿透小室的細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（54.5±9.6個/高倍鏡視野vs.45.6±7.3個/高倍鏡視野，P＞0.05）;過表達(dá)LINC00628的MGC-803細(xì)胞與對照組細(xì)胞穿透小室的細(xì)胞數(shù)量差異同樣無統(tǒng)計學(xué)意義（57.5±4.6個/高倍鏡視野vs.66.2±8.1個/高倍鏡視野，P＞0.05）。細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示:干擾LINC00628的SGC-7901胃癌細(xì)胞進(jìn)入S期

12、比例顯著高于對照組細(xì)胞(48.72±2.66％ vs.38.54±2.13％)，而停滯于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著低于對照組(28.91±2.52％vs.40.85±1.96％)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);過表達(dá)LINC00628的MGC-803胃癌細(xì)胞進(jìn)入S期比例顯著低于對照組細(xì)胞(28.12±1.04％vs.40.46±2.33％)，停滯于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著高于對照組(48.69±1.72％ vs.40.22±1.

13、14％)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示:干擾LINC00628的SGC-7901細(xì)胞凋亡率與對照組細(xì)胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義(19.86±0.84％ vs.21.08±1.17％，P＞0.05);過表達(dá)LINC00628的MGC-803細(xì)胞凋亡率與對照組細(xì)胞差異同樣無統(tǒng)計學(xué)意義(11.15±0.81％vs.9.62±0.96％，P＞0.05)。裸鼠皮下成瘤實驗結(jié)果顯示:干擾LINC00628的SGC-7901胃癌細(xì)胞

14、皮下成瘤重量較對照組細(xì)胞顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.93±0.22g vs.0.32±0.11g，P＜0.001);而過表達(dá)LINC00628的MGC-803細(xì)胞成瘤重量較對照組顯著減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.14±0.05g vs.0.30±0.08g，P=0.005)。4)39例胃癌腫瘤組織中LINC00628及LRRN2的Realtime PCR檢測結(jié)果相關(guān)性分析結(jié)果顯示:LINC00628與LRRN2在胃癌組織中的表達(dá)存在顯

15、著性正相關(guān)（Pearson相關(guān)系數(shù)=0.3338，P＜0.05）。檢測干擾、過表達(dá)LINC00628的胃癌細(xì)胞中LRRN2 mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示:干擾LINC00628后胃癌細(xì)胞中LRRN2 mRNA和蛋白的表達(dá)與對照組無明顯變化;而過表達(dá)LINC00628后胃癌細(xì)胞中LRRN2 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加。通過siRNA片段干擾Lenti-LINC00628-MGC-803細(xì)胞中LRRN2基因的表達(dá)，進(jìn)一步行CCK8檢測，

16、結(jié)果顯示干擾LRRN2表達(dá)并不能改變上調(diào)LINC00628對胃癌細(xì)胞MGC-803增殖能力造成的抑制影響。5）對干擾、過表達(dá)LINC00628的SGC-7901和MGC-803胃癌細(xì)胞分別進(jìn)行表達(dá)譜基因芯片檢測，共發(fā)現(xiàn)16條差異表達(dá)的編碼蛋白基因在兩組細(xì)胞中變化趨勢相反，其中MAPK4和HEY1兩條可能具有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的基因在干擾LINC00628的胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，在過表達(dá)LINC00628的胃癌細(xì)胞中低表達(dá);MT1G和MT1F兩

17、條可能具有抑制細(xì)胞增殖功能的基因表達(dá)變化趨勢則相反。Realtime PCR及western blot檢測結(jié)果顯示:MAPK4 mRNA和蛋白在干擾LINC00628的SGC-7901胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平明顯上升，而在過表達(dá)LINC00628的MGC-803胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平明顯下降。
　　[結(jié)論]1）LncRNA-LINC00628在胃癌腫瘤組織中異常高表達(dá)，具備成為胃癌輔助性診斷分子指標(biāo)物的潛能。2）LncRNA-LINC006

18、28在胃癌腫瘤組織中的表達(dá)水平與腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯及患者總生存率密切相關(guān)，LINC00628高表達(dá)胃癌的病程相對較早、預(yù)后更好。提示LINC00628可作為判斷胃癌患者預(yù)后的參考指標(biāo)。3）LncRNA-LINC00628可以增加胃癌細(xì)胞G0/G1期阻滯，減少進(jìn)入S期細(xì)胞數(shù)量，并抑制胃癌細(xì)胞增殖;同時其對于胃癌細(xì)胞遷移具有抑制功能。但其對于胃癌細(xì)胞凋亡、侵襲能力無影響。4）LncRNA-LINC00628對于

19、鄰近編碼蛋白基因LRRN2具有一定正向調(diào)控作用，但這種調(diào)控現(xiàn)象并不是LINC00628在胃癌中發(fā)揮生物學(xué)功能的作用機(jī)制。5）LncRNA-LINC00628能夠發(fā)揮遠(yuǎn)距離一對多的基因調(diào)控作用，其直接或間接調(diào)控的下游靶基因包括:MAPK4、HEY1、MT1G和MT1F。LncRNA-LINC00628對于MAPK家族成員MAPK4具有負(fù)調(diào)控作用，LINC00628對于MAPK4相關(guān)信號通路的調(diào)控可能是其影響胃癌細(xì)胞周期、抑制胃癌細(xì)胞增殖的