清化固腎排毒顆粒對腎纖維化的保護作用以及其對wnt信號通路機制的研究.pdf

1、目的:本研究通過建立大鼠單側輸尿管梗阻(Unilateral Ureteral Obstruction)模型，檢測wnt信號通路蛋白wnt1、β連環(huán)蛋白(β-catenin)，α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)等蛋白及基因的表達，從而探討清化固腎排毒顆粒對腎間質纖維化的保護作用以及其對wnt信號通路的作用機制。
　　方法:將72只SPF級SD大鼠隨機分為假手術組和造模組，造模組采取單側輸尿管結扎，

2、造模后再隨機分為UUO模型組、洛丁新組、中藥組，每組SD大鼠18只。中藥組予以清化固腎排毒顆粒1.5g/kg.d溶于生理鹽水中灌胃，西藥組予以洛丁新片1.6mg/kg.d溶于生理鹽水中灌胃，假手術組和模型組予以生理鹽水灌胃，每日一次。分別于造模后的第7、14、21天時隨機處死每組中的6只大鼠，心臟取血檢測血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(serumcreatinine，SCr)、并留取梗阻側腎臟組織進行

3、相關病理檢測。分別采用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining， HE染色）和Masson染色評價腎小管損傷情況和腎間質纖維化程度，運用免疫組織化學染色和實時熒光定量PCR以及Westem Blot技術檢測腎臟組織wnt1、β-catenin、α-SMA、TGF-β1的蛋白和mRNA在腎組織中的表達情況。
　　結果:
　　1.清化固腎排毒顆粒對UUO大鼠腎臟病理的影響(1) HE染色結果:假手

4、術組未見明顯病理改變。模型組腎臟可見腎小管管腔擴張、間質增寬，小管上皮細胞變性、萎縮、壞死、脫落以及炎性細胞浸潤，腎間質纖維化，隨著梗阻時間延長，損傷程度進一步加重。洛丁新組、中藥組腎小管上皮細胞變性、壞死、萎縮程度和間質纖維化程度較模型組輕(P＜0.05)，腎小管損傷程度評分明顯減少(P＜0.05)，中藥組與洛丁新組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(2) Masson染色結果:在假手術組，腎組織masson染色未見明顯病理改變

5、，僅見少量線狀藍染的膠原組織。在模型組，可見腎小囊、腎小管基膜及間質出現明顯藍染的膠原組織(P＜0.05)，隨著梗阻時間的延長，腎間質中藍染的成分逐漸增多，提示纖維化程度進行性加重。中藥組及洛丁新組Masson評分，較模型組明顯減少(P＜0.05)，中藥組與洛丁新組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.清化固腎排毒顆粒對UUO大鼠腎功能的影響與假手術組比較，模型組大鼠 SCr、BUN均明顯升高(P＜0.05);與模型組

6、比較，中藥組和洛丁新組SCr、BUN均明顯降低(P＜0.05)，中藥組與洛丁新組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3.對大鼠24 hUP的影響各組大鼠24 hUP量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，隨著時間的延長，各組大鼠24 hUP量變化差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　4.免疫組織化學染色結果:與假手術組比較，各模組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA、β-catenin表達明顯增多(P＜0.05)，隨著

7、輸尿管梗阻時間延長，各指標程度加重;與模型組比較，中藥組、洛丁新組大鼠的TGF-β1、α-SMA、β-catenin表達降低(P＜0.05); Wnt1免疫組化結果顯示:與假手術組比較，各造模組大鼠腎小管上皮細胞內wnt1高表達(P＜0.05)，在梗阻后第7天wnt1表達量最高(P＜0.05)，隨后降低，中藥組與洛丁新組比較，各指標差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　5.實時熒光定量PCR結果與假手術組比較，各模組大鼠腎組織T

8、GF-β1mRNA、α-SMA mRNA，β-catenin mRNA表達明顯增多(P＜0.05)，隨著輸尿管梗阻時間延長，各指標程度加重;與模型組比較，中藥組、洛丁新組大鼠的TGF-β1mRNA、α-SMAmRNA、β-catenin mRNA表達降低(P＜0.05)。Wnt1 mRNA結果顯示:與假手術組比較，各造模組大鼠腎小管上皮細胞內wnt1 mRNA高表達(P＜0.05)，在梗阻后第7天wnt1mRNA表達量最高(P＜0.05

9、)，隨后降低;與模型組比較，中藥組、洛丁新組大鼠wnt1mRNA表達降低(P＜0.05);中藥組與洛丁新組比較，各指標差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)
　　6.Westem Blot結果與假手術組比較，各模組大鼠腎組織β-catenin蛋白含量表達明顯增多（P＜0.05)，隨著輸尿管梗阻時間延長，表達程度加重;與模型組比較，中藥組、洛丁新組大鼠的β-catenin蛋白含量表達降低（P＜0.05）。Wnt1結果顯示:與假手術組比較，

10、各造模組大鼠腎小管上皮細胞內wnt1蛋白含量高表達（P＜0.05)，在梗阻后第7天wnt1表達量最高(P0.05)，隨后降低;與模型組比較，中藥組、洛丁新組大鼠wnt1蛋白含量表達降低（P＜0.05)，中藥組與洛丁新組比較，各指標差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結論:
　　1、成功建立單側輸尿管結扎大鼠腎纖維化模型;
　　2、清化固腎排毒顆粒能夠對UUO大鼠腎臟具有一定的保護作用，一定程度改善腎功能及腎臟病理，