腦腸肽對(duì)腎間質(zhì)纖維化療效及作用機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述：
　　第一部分腦腸肽對(duì)UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化影響及機(jī)制
　　目的:
　　觀察腦腸肽對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎(Unilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型RIF及相關(guān)纖維化因子表達(dá)的影響;進(jìn)而探討腦腸肽抗腎臟纖維化的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)分組及模型制作
　　將雄性SD大鼠（40只）隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組（Sham+

2、 Vehicle），假手術(shù)組+腦腸肽治療組（Sham+ Ghrelin），模型組(UUO+ Vehicle)，腦腸肽治療組(UUO+ Ghrclin)。模型組及腦腸肽治療組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎制成大鼠UUO模型。而假手術(shù)組大鼠僅分離左側(cè)輸尿管，不進(jìn)行結(jié)扎，麻醉及其余手術(shù)步驟與模型組相同。術(shù)后14天處死大鼠，收集腎臟標(biāo)本進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)。
　　2、Masson染色
　　按常規(guī)方法行Masson染色。取Masson染色切片，每例

3、切片高倍鏡下(×200)觀察10個(gè)互不重疊腎小管間質(zhì)視野，熒光顯微鏡下觀察、拍照、分析。
　　3、腎臟組織石蠟切片制作
　　大鼠麻醉后，分別用生理鹽水和4％多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注。梗阻側(cè)腎臟組織，于4％多聚甲醛溶液中浸泡24小時(shí)后，按照常規(guī)石蠟包埋法制成石蠟標(biāo)本并切片，切片厚度為3μm，撈片、風(fēng)干后備用。
　　4、免疫組化
　　組織切片經(jīng)脫蠟、水化，在檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L)中給予微波熱修復(fù)30min

4、。適度冷卻后依次給予0.3％過氧化氫溶液、山羊血清、一抗、生物素化二抗和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液封閉和孵育。DAB顯色液顯色，中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察并拍照。
　　5、免疫熒光
　　石蠟切片脫蠟至水，在Tris-EDTA(PH8.5)或檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L)中給予微波熱修復(fù)，血清封閉后滴加一抗，4℃孵育12-24h，PBS溶液洗滌后滴加相應(yīng)熒光二抗，37℃孵育1h。熒光顯微鏡下觀察、拍照、分析。
　

5、　6、Western Blot方法檢測(cè)蛋白表達(dá)變化
　　大鼠麻醉后處死，取梗阻側(cè)腎臟組織約100mg，液氮中保存?zhèn)溆谩＝M織標(biāo)本經(jīng)勻漿、裂解、離心(12000rpm，5℃，10min)后，蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。蛋白裂解液依次經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗及二抗孵育、顯影及定影。凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析α-SMA、E-cadherin、FN、col-Ⅰ、col-Ⅲ、TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá)變化。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法<

6、br>　　采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用ONE-WAY方差分析，多重比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　(1) Masson染色結(jié)果顯示UUO術(shù)后14天模型組大鼠梗阻側(cè)腎組織見明顯間質(zhì)纖維化病理改變;與模型組相比，腦腸肽治療組RIF面積明顯減少。免疫組化結(jié)果顯示UUO術(shù)后14天模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟可見大量FN，col-Ⅰ

7、蛋白表達(dá);而腦腸肽治療組大鼠梗阻側(cè)腎臟FN，col-Ⅰ，col-Ⅲ蛋白明顯下降。
　　(2) WB結(jié)果顯示UUO術(shù)后14天模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟TGF-β1，p-Smad3表達(dá)明顯增多;腦腸肽干預(yù)組TGF-β1，p-Smad3表達(dá)則較前明顯下降。TGF-β1免疫組化染色結(jié)果與WB結(jié)果相似。
　　(3)免疫組化結(jié)果顯示UUO術(shù)后14天模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟α-SMA，E-cadherin，F(xiàn)N的表達(dá)增多，E-cadherin的表達(dá)

8、減少;腦腸肽干預(yù)后α-SMA，F(xiàn)N的表達(dá)明顯下降，E-cadherin無明顯下降。WB的結(jié)果同樣證實(shí)腦腸肽治療組大鼠梗阻側(cè)腎臟α-SMA，F(xiàn)N的表達(dá)下降，而E-cadherin的表達(dá)無明顯下降。
　　結(jié)論:
　　(1)腦腸肽具有抗腎間質(zhì)纖維化作用。
　　(2)腦腸肽能通過阻斷TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，從而抑制腎間質(zhì)纖維化。
　　(3)腦腸肽能夠通過抑制腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial mesen

9、chymaltransition，EMT)過程，從而抑制腎間質(zhì)纖維化。
　　第二部分腦腸肽對(duì)纖維化炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制
　　目的:
　　觀察腦腸肽對(duì)UUO大鼠腎組織炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)，炎癥因子、趨化因子表達(dá)和對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響;探討腦腸肽抗腎臟炎癥及腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)分組及模型制作
　　將雄性SD大鼠（40只）隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組（Sham+ Vehicle），假手

10、術(shù)組+腦腸肽治療組（Sham+ Ghrelin），模型組(UUO+ Vehicle)，腦腸肽治療組(UUO+ Ghrelin)。模型組及腦腸肽治療組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎制成大鼠UUO模型。而假手術(shù)組大鼠僅分離左側(cè)輸尿管，不進(jìn)行結(jié)扎，麻醉及其余手術(shù)步驟與模型組相同。術(shù)后7天處死大鼠，收集腎臟標(biāo)本進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)。
　　2、腎臟組織石蠟切片制作（實(shí)驗(yàn)方法同前）
　　3、免疫組化（實(shí)驗(yàn)方法同前）
　　4、Western Bl

11、ot方法檢測(cè)蛋白表達(dá)變化（實(shí)驗(yàn)方法同前）
　　5、TUNEL染色
　　應(yīng)用TUNEL方法，按照In Situ Cell Death Detection Kit(Roche)的步奏進(jìn)行，蘇木精復(fù)染核，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。每張切片高倍鏡下(×400)依次觀察腎間質(zhì)區(qū)域20個(gè)不重疊視野，計(jì)數(shù)TUNEL陽性的細(xì)胞數(shù)。
　　6、Real-time PCR
　　RT-PCR Trizol法提取組織RNA，并進(jìn)行質(zhì)檢，

12、質(zhì)檢合格后逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA，并通過Prime5.0進(jìn)行引物序列設(shè)計(jì)。IL-1β上游引物:5'-CCTCTGACAGGC AAC CAC TTA-3';MCP-1上游引物:5'-GTGTCCCAAAGAAGCTGTAGTATT-3'，下游引物:5'-GTG CTG AAG TCC TTA GGG TGA-3';TNF-α上游引物:5'-GTC GTA GCA AAC CAC CAA GCC-3'，下游引物:5'-CTC CTG GTA

13、 TGAAAT GGC AAA-3'。按照按SYBRpremixExTa說明書進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)時(shí)熒光定量利用PCR技術(shù)通過2-ΔΔCT方法分析相對(duì)基因表達(dá)差異數(shù)據(jù)分析。GAPDH作為內(nèi)參。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用ONE-WAY方差分析，多重比較用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　(1)

14、免疫組化結(jié)果顯示UUO術(shù)后7天模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟可見大量炎癥細(xì)胞侵潤(rùn);腦腸肽治療組間質(zhì)炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)明顯減少。
　　(2) UUO術(shù)后7天模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟炎癥及趨化因子(IL-1β、MCP-1、TNF-α) mRNA的表達(dá)水平明顯升高;腦腸肽治療組炎癥及趨化因子mRNA的表達(dá)水平顯著下降。
　　(3) UUO術(shù)后7天模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟p-p65表達(dá)水平明顯增高;腦腸肽治療組p-p65表達(dá)水平顯著下降。
　　(4)

15、 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)染色結(jié)果顯示UUO術(shù)后7天模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟腎小管上皮細(xì)胞(Tubularepithelial cells，TECs)凋亡細(xì)胞明顯增多;腦腸肽治療組凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。
　　結(jié)論:
　　(1)腦腸肽能夠通過抑制炎癥及趨化因子的表達(dá)，從而抑制炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)，進(jìn)而有效減輕梗阻側(cè)腎臟的炎癥反應(yīng)