巴西紅耳龜紅細胞血影蛋白質(zhì)組學(xué)及對其低溫缺氧抗性機理的研究.pdf

1、龜類在動物界中屬于脊索動物門、脊椎動物亞門、爬行綱、龜鱉亞綱、龜鱉目。龜類在進化史上屬于活化石類的生物，以長壽而聞名，具有超強的耐低溫和耐缺氧特性。耐低溫耐缺氧機理研究具有非常重要的意義，例如在細胞冷凍過程中防止細胞被冰晶損傷，在器官移植手術(shù)中，離體器官長期保存而不會出現(xiàn)缺血/缺氧而造成的衰竭，保證再充血再充氧這樣的再灌注過程中不被大量產(chǎn)生的自由基損傷，提高被遠距離運送的重傷員的成活率等，甚至還有些仿生學(xué)科學(xué)家希望通過將人體通過類似的低

2、溫低氧“窖藏”的方式來延長生命。
　　 龜類具有一些非常特殊的身體結(jié)構(gòu)，其紅細胞尤為特殊。龜類紅細胞像大多數(shù)低等脊椎動物的紅細胞一樣為橢圓形，體積大且有核，不同之處在于成熟的龜類紅細胞不含有線粒體。有的研究者指出龜類紅細胞在進化史上與哺乳動物最接近，所以，可以把龜?shù)募t細胞定位于低等脊椎動物與高等脊椎動物紅細胞之間。但是到目前為止，科學(xué)界對龜類紅細胞的組成，尤其是對細胞保護，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，物質(zhì)運輸有重要意義的細胞膜的組成知之甚少。如此

3、特殊的紅細胞結(jié)構(gòu)及其與龜類超強的抗缺氧抗應(yīng)激耐力的關(guān)系是本研究探討的關(guān)鍵科學(xué)問題。本文以蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)技術(shù)對巴西紅耳龜血影的全蛋白質(zhì)組學(xué)進行了研究，并發(fā)現(xiàn)了一些與巴西紅耳龜?shù)蜏厝毖跄褪苤苯酉嚓P(guān)的蛋白，進而研究了其在巴西紅耳龜?shù)蜏厝毖踹^程中可能發(fā)揮的作用及作用機理。
　　 首先，本文以巴西紅耳龜（Red-earedturtle，Trachemysscripta）為研究材料，著眼于如何獲得高純度的巴西紅耳龜紅細胞血影，由于巴西紅耳

4、龜紅細胞既有類似體細胞的復(fù)雜性，其細胞膜又具有哺乳動物紅細胞的脆弱性，以至于分離體細胞的劇烈細胞破碎方法和分離哺乳動物紅細胞的相對溫和的低滲裂解法都不適用于分離龜類的紅細胞。所以，純化其紅細胞血影是一項挑戰(zhàn)。在本研究之前，未發(fā)現(xiàn)有詳細的關(guān)于如何分離純化巴西紅耳龜紅細胞血影的方法。本實驗室在已有的研究報道的基礎(chǔ)上通過反復(fù)摸索，最終總結(jié)出了一套有效的分離方法，通過富集紅細胞，低滲裂解，具特殊針頭注射器的吹打，低速勻漿以及差速離心的方法，我們

5、最終獲得了滿足蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定要求的血影。并通過4種不同的樣品前處理與不同的質(zhì)譜鑒定方法相結(jié)合，介紹了一套有效的巴西紅耳龜紅細胞血影的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，共鑒定得到169個非冗余蛋白質(zhì)并對其中有意義的蛋白質(zhì)進行了深入的探討，發(fā)現(xiàn)了一些與巴西紅耳龜超強耐力相關(guān)的蛋白，如微管蛋白，熱休克蛋白，以及定位在“紅細胞膜上”的與產(chǎn)能直接相關(guān)的蛋白——F型ATP合酶亞單位。紅細胞“非線粒體微生物樣供能”為巴西紅耳龜?shù)目鼓嫔鏅C理研究打開了一個全新的視野

6、。
　　 其次，我們對巴西紅耳龜進行了一周低溫潛水處理，測定了一些與能量代謝相關(guān)的關(guān)鍵生化指標，發(fā)現(xiàn)了巴西紅耳龜在短期低溫潛水期間無氧糖酵解與糖異生同時進行的能量代謝方式。對短期低溫潛水期間巴西紅耳龜體內(nèi)肝糖原和肌糖原儲備沒有被消耗而血糖升高的現(xiàn)象作出了獨特的闡釋。
　　 最后，我們結(jié)合短期低溫潛水期間能量代謝的特點以及前人的研究基礎(chǔ)，進行了血液體外ATP剝奪實驗，證實了巴西紅耳龜紅細胞具有向細胞外產(chǎn)生ATP的特性?？赡?/p>

7、的產(chǎn)能機理是紅細胞利用細胞內(nèi)比細胞外高出約5倍的氫離子推動細胞膜上的ATP合酶合成ATP。并在此基礎(chǔ)上提出了巴西紅耳龜短期低溫潛水期間的能量代謝模型假說。
　　 總之，本研究從巴西紅耳龜血影的分離純化到血影蛋白的高效酶切，再到質(zhì)譜鑒定，生物信息學(xué)分析，系統(tǒng)地提出了一套針對巴西紅耳龜甚至是有核紅細胞血影的組學(xué)分析方法。同時，對巴西紅耳龜短期低溫缺氧能量代謝機理進行了探討，發(fā)現(xiàn)巴西紅耳龜紅細胞除了攜帶氧的作用外，還可能具有供能作用。