內質網應激在高果糖誘導HepG2細胞脂質從頭合成中的作用.pdf

1、非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指非酒精所致（每日飲酒量小于10克），以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。隨著人們飲食結構、生活方式的改變，其發(fā)病率在全球范圍呈逐年上升趨勢。NAFLD疾病譜隨病程的進展而表現(xiàn)不一，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化甚至肝細胞癌，大部分患者僅為單純性脂肪肝，也簡稱為“脂肪肝”。脂質合成增多、脂肪酸代謝

2、和運輸障礙、胰島素抵抗、氧化應激、炎癥反應、腸道菌群失調、線粒體功能異常等是導致NAFLD發(fā)生發(fā)展的重要機制，而其病理基礎是肝細胞脂肪變性。當肝臟脂質合成增加和細胞內游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)水平升高，超過了脂肪酸的利用（β氧化能力）及極低密度脂蛋白(VLDL)的輸出水平時，過多的甘油三酯(TG)聚集，進而導致肝臟中脂質沉積形成肝細胞脂肪變性。正常情況下，由乙酰輔酶A從頭合成產生的TG僅為總合成TG的5％，在病

3、理狀態(tài)下，肝細胞脂質從頭合成產生的TG可以達到三分之一。因此，脂質從頭合成增多是導致NAFLD脂質沉積的重要機制。
　　在真核細胞中，內質網是負責蛋白質合成、折疊、加工、轉運及其質量監(jiān)控的重要細胞器。在缺氧、高脂等環(huán)境時，內質網中未折疊或是錯誤折疊蛋白增多，激活細胞的保護性措施未折疊蛋白反應(unrolded proteinresponse，UPR)，當適應性機制仍不能有效清除未折疊或錯誤折疊的蛋白，超出負荷時則引發(fā)內質網應激(e

4、ndoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS有三條途徑分別為PKR樣ER調節(jié)激酶[pancreatic ER kinase(PKR)-like ERkinase，PERK又稱雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶]/真核細胞轉錄起始因子-2α（eukaryotic initiation factor-2α，eIF-2α）/活化轉錄因子-4(activating transcription factor4，ATF-

5、4)通路，肌醇需酶-1[(inositol requiringenzyme-1，IRE-1)又稱抑制物阻抗性酯酶-1]/X盒結合蛋白(X-Bindingprotein-1，XBP-1)和活化轉錄因子-6(activating transcription factor-6，ATF-6)，最近研究發(fā)現(xiàn)ERS與糖脂代謝密切相關，可能是導致NAFLD脂質沉積的重要機制。
　　隨著上世紀70年代高果糖玉米糖漿(HFCS)引入食品加工業(yè)后，含

6、果糖的食品和軟飲料攝入量增加，臨床和動物研究發(fā)現(xiàn)高果糖攝入與人群的肥胖、血脂異常、代謝綜合征、NAFLD相關。由于高脂飲食是已知的導致NAFLD的重要誘因，我們課題組之前采用高果糖或高脂飲食喂養(yǎng)大鼠，結果發(fā)現(xiàn)二者均可誘發(fā)肝內脂質沉積和高甘油三脂血癥，也證實短期（1周）和長期（16周）高果糖喂養(yǎng)均可誘導出小鼠NAFLD模型，出現(xiàn)肝臟脂質沉積，增加了小鼠肝臟內源性脂質合成率，促進脂質從頭合成，上調參與脂質從頭合成的上游調控因子固醇調節(jié)元件結

7、合蛋白-1c(Sterolregulatory element binding protein-1 c，SREBP-1c)和碳水化合物反應元件結合蛋白(carbohydrate response element binding protein，ChREBP)及三個關鍵酶乙酰輔酶A羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)和硬脂酰CoA脫飽和

8、酶-1(stearoyl-CoAdesaturase-1，SCD-1)，高脂飲食也可以引起肝臟脂質沉積，但是對脂質從頭合成的影響則與高果糖飲食相反，并且高果糖飲食導致ERS出現(xiàn)，因此前期的動物實驗提示ERS可能介導高果糖誘導NAFLD脂質從頭合成增加的重要機制。近來已有大量的文獻證實了果糖可以導致脂肪肝，并且發(fā)現(xiàn)應用內質網應激抑制劑4-苯基丁酸(4-phenyl butyric acid，4-PBA)或?；切苋パ跄懰?taurourso

9、deoxycholate，TUDCA)可以改善肝臟脂質沉積，單獨應用內質網誘導劑可以導致細胞TG升高，而另有研究發(fā)現(xiàn)高脂環(huán)境可導致ERS，因此ERS和脂質從頭合成之間的相互關系及果糖促脂質從頭合成增加的始動機制尚不明確。動物研究發(fā)現(xiàn)敲低PERK小鼠可避免高脂環(huán)境誘導的NAFLD，敲低XBP-1可以改善小鼠脂肪肝?？墒怯捎趧游镅芯看嬖诙喾N干擾因素，目前的研究尚缺乏細胞水平的對ERS單條通路在高果糖誘導NAFLD作用機制中的研究。因此，本研

10、究首先應用高果糖(fructose)或高棕櫚酸(palmitic acid，PA)培養(yǎng)HepG2細胞，觀察細胞甘油三酯(TG)含量、細胞脂質沉積，其次觀察了果糖和棕櫚酸對脂質從頭合成的影響;再分別應用兩種ERS抑制劑和兩種ERS誘導劑，觀察ERS對脂質從頭合成的影響，探討ERS對脂質從頭合成的影響;最后分別利用細胞轉染的方法靶向上調和下調PERK/eIF-2α/ATF-4通路中的ATF-4和IRE-1/XBP-1通路中的XBP-1，觀察

11、單條通路對肝細胞脂質合成的影響，從而在體外細胞水平研究高果糖飲食對脂代謝的危害，探討ERS中單條通路在NAFLD發(fā)生機制中作用。
　　第一部分果糖和棕櫚酸對HepG2細胞脂質從頭合成中的不同影響
　　目的:探討果糖和棕櫚酸(palmitic acid, PA)對HepG2細胞甘油三酯的影響及機制，并確立高果糖造成NAFLD的細胞模型。
　　方法:采用普通培養(yǎng)基和不同濃度(1、5、20mmol/L)果糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG

12、2細胞（分別簡稱為N、F1、F5、F20組），干預不同時間(12、24、48、72h)后觀察HepG2細胞TG水平和脂質沉積，采用GPO-PAP法測定TG，油紅O染色反應脂質沉積;再使用普通培養(yǎng)基（N組）、20mmol/L果糖干預72h（簡稱F組）或0.2mmol/L棕櫚酸干預24h（簡稱PA組），測定各組肝細胞脂質從頭合成相關的上游轉錄因子SREBP-1c和ChREBP的基因表達水平及三個下游關鍵酶ACC、FAS和SCD-1的蛋白表達

13、水平。
　　結果:1不同濃度果糖干預不同時間對HepG2細胞TG水平的影響:應用果糖培養(yǎng)HepG2細胞12小時，F(xiàn)20組的TG水平明顯高于N組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，F(xiàn)1和F5組與N組比較，有升高趨勢，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);培養(yǎng)24小時F20組的TG水平明顯高于N組(P＜0.01)，F(xiàn)5組的TG水平明顯高于N組(P＜0.05)、F1組有升高趨勢，但是無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);培養(yǎng)48或72小時，F(xiàn)5、F20

14、組的TG水平明顯高于N組（均P＜0.01），F(xiàn)1組較N組有升高趨勢，但是無統(tǒng)計學意義，(P＞0.05)，提示干預時間相同，TG隨果糖濃度增加而增加，呈劑量依賴關系;果糖濃度相同，TG的水平隨著干預的時間延長逐漸增加，呈時間依賴關系，20mmol/L的果糖，干預72小時TG達到最高值。2不同濃度的果糖培養(yǎng)HepG2細胞72小時后對脂質沉積的影響:油紅O染色顯示N組少見紅染，被油紅染色的大小不一的脂滴隨著果糖濃度增加而增加，F(xiàn)20組紅染脂滴

15、最多。3果糖和棕櫚酸對細胞TG水平的影響:F和PA組的肝細胞TG均較與N組升高（均P＜0.01），兩組之間無明顯差異(P＞0.05)。4果糖和棕櫚酸對脂質從頭合成上游調控因子和關鍵酶的影響:F組比N組的肝內ChREBP基因表達增加18倍(P＜0.01)，PA組無明顯變化，F(xiàn)組比N組的肝內SREBP-1c基因表達增加5倍(P＜0.01)，PA組比N組的肝內SREBP-1c基因表達增加2.4倍(P＜0.01)，比F組明顯降低，有統(tǒng)計學差異(

16、P＜0.01）;F組比N組的肝內ACC、FAS、SCD-1蛋白表達明顯增加（均P＜0.05），PA組與N組相比無顯著差異。
　　結論:1高果糖培養(yǎng)HepG2細胞可以引起肝細胞脂質沉積;2肝細胞的脂質沉積程度與果糖的濃度呈劑量依賴性關系，與干預時間呈時間依賴關系，20mmol/L的果糖濃度孵育72小時TG水平達到最高值，肝細胞脂質沉積最明顯，確定了果糖的干預濃度為20mmol/L孵育時間為72小時;3高棕櫚酸培養(yǎng)HepG2細胞引起脂

17、質沉積程度與高果糖一致;4高果糖干預比高棕櫚酸，明顯促進了HepG2細胞脂質從頭合成相關的上游調控因子SREBP-1c、ChREBP和下游關鍵酶ACC、FAS、SCD-1的表達水平。
　　第二部分內質網應激對脂質從頭合成的影響研究
　　目的:分別使用兩種內質網應激抑制劑4-PBA、TUDCA干預高果糖培養(yǎng)的HepG2細胞，并分別使用兩種ERS誘導劑Tunicamycin、Thapsigagin干預HepG2細胞，觀察ERS對

18、肝臟內源性脂質從頭合成的影響。
　　方法:首先分別加入兩種不同內質網應激抑制劑4-PBA(20mmol/L，簡稱4-PBA組)、TUDCA（0.2mmol/L，簡稱TUDCA組）干預高果糖培養(yǎng)基的HepG2細胞，之后分別加入兩種ERS誘導劑Tunicamycin(2μg/ml，簡稱為Tm組)和Thapsigagin(600nmol/L，簡稱Tg組)誘導HepG2細胞;最后利用Western的方法測定各組p-PERK、 p-eIF-

19、2α/eIF-2α、ATF-4、p-IRE-1/IRE-1和XBP-1s，測定TG水平和油紅O染色觀察細胞脂質沉積，檢測各組與肝臟脂質從頭合成的上游轉錄因子SREBP-1c和ChREBP的基因水平，以及下游脂質合成的關鍵酶類ACC、FAS、SCD-1的蛋白水平。
　　結果:1觀察ERS抑制劑對ERS的影響:F組的p-PERK、p-IRE-1/IRE-1、p-IRE-1/IRE-1、ATF-4和XBP-1s的蛋白水平較N組明顯升高（

20、均P＜0.01），TUDCA組p-PERK、p-IRE-1/IRE-1、XBP-1s均表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），p-eIF-2α/eIF-2α、ATF-4均表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），4-PBA組p-PERK、p-eIF-2α/eIF-2α、ATF-4均表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），p-IRE-1/IRE-1、XBP-1s均表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），兩種抑制劑確實

21、減少了PERK/eIF-2α/ATF-4和IRE-1/XBP-1的兩條通路蛋白表達;2觀察ERS抑制劑對脂質沉積的影響:TUDCA組TG減少了40％（P＜0.01），油紅O染色顯示較F組脂滴明顯減少，4-PBA組減少50％(P＜0.01)，油紅O染色顯示4-PBA組較F20組脂滴明顯減少;3觀察ERS抑制劑對脂質從頭合成的影響:TUDCA組較F組SREBP-1c降低了20％(P＜0.01)，ChREBP降低了15％(P＜0.05)，AC

22、C、FAS、SCD-1表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)，4-PBA組較F組SREBP-1c降低了40％(P＜0.01)，ChREBP降低了42％(P＜0.05)，ACC降低了33％(P＜0.05)、FAS、SCD-1下降了28％和25％，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）;4觀察ERS誘導劑對ERS的影響:Tg組的p-PERK、p-IRE-1/IRE-1、p-IRE-1/IRE-1、ATF-4和XBP-1s的蛋白水平較N組明

23、顯升高，有統(tǒng)計學意義(均P＜0.01)，Tm組較N組明顯升高，有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）;5觀察ERS誘導劑對脂質沉積的影響:Tg刺激后較N組TG升高了200％(P＜0.01)，Tm刺激后較N組TG升高為180％(P＜0.05)，油紅O染色顯示的Tg和Tm組培養(yǎng)的HepG2細胞脂滴明顯增多;6觀察ERS誘導劑對脂質從頭合成的影響:與N組比較，Tg組SREBP-1c、ChREBP表達增加（均P＜0.01），F(xiàn)AS表達增加(P＜0.01

24、)，ACC和SCD-1表達增加(均P＜0.05)，與N組比較，Tm組SREBP-1c、ChREBP表達增加（均P＜0.01），F(xiàn)AS、ACC和SCD-1表達增加（均P＜0.01）。
　　結論:1高果糖培養(yǎng)HepG2細胞可引起ERS;兩種ERS抑制劑4-PBA和TUDCA均可以降低高果糖所致HepG2細胞內TG水平的升高，減輕HepG2細胞的脂質沉積，抑制高果糖誘導的SREBP-1c、ChREBP的基因和ACC、SCD-1、FAS的

25、蛋白表達水平的增加，因此提示ERS與脂質從頭合成密切相關;2應用兩種ERS誘導劑Tunicmycin和Thapsigargin引起ERS，使肝細胞脂質沉積增多，顯著增加肝臟脂質合成酶的上游轉錄因子SREBP-1c、ChREBP的基因和ACC、SCD-1、FAS的蛋白表達水平，因此提示ERS可能參與脂質從頭合成增多所致的肝細胞脂質沉積。
　　第三部分 IRE-1/XBP-1信號通路對HepG2細胞脂質從頭合成的影響
　　目的:

26、探討敲低XBP-1或過表達XBP-1s對HepG2細胞的TG，脂質沉積和SREBP-1c、ChREBP、ACC、FAS、SCD-1的影響。
　　方法:首先轉染針對HepG細胞XBP-1的shRNA，分為四組:正常對照組（簡稱N組）、高果糖組（簡稱F組）、高果糖+陰性對照組（簡稱F+NC組）、高果糖+XBP-1 shRNA組（簡稱F+ XBP-1 shRNA組），再分別轉染針對HepG細胞XBP-1s和XBP-1u的過表達質粒，分為

27、四組:未轉染組（簡稱Untransfection組）、陰性對照組(簡稱pcDNA3.1(+)組）、XBP-1u上調組[簡稱pcDNA3.1(+)-XBP-1u組]、XBP-1s上調組[簡稱pcDNA3.1(+)-XBP-1s上調組]，測定各組HepG2細胞內TG水平和油紅O染色觀察細胞脂質沉積，檢測各組與肝臟脂質從頭合成的上游轉錄因子SREBP-1c和ChREBP的基因水平，以及下游脂質合成的關鍵酶類ACC、FAS、SCD-1的蛋白水平

28、。
　　結果:1轉染XBP-1 shRNA對XBP-1s的影響:F+XBP-1 shRNA組的XBP-1s的表達水平比F組都顯著降低大于70％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，說明XBP-1s表達水平被有效抑制;2轉染XBP-1 shRNA對HepG2細胞脂質沉積的影響:F+XBP-1 shRNA組TG比F組降低了34％，有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），油紅O染色示脂滴減少，F(xiàn)+NC組TG無變化(P＞0.05)，油紅O染色示大量紅

29、染，與F組無明顯差異;3轉染XBP-1shRNA對脂質從頭合成的影響:F+XBP-1 shRNA組與F組比較SREBP-1c的基因水平降低了40％(P＜0.01)，ChREBP無明顯變化(P＞0.05)，ACC的蛋白表達水平降低（P＜0.01），F(xiàn)AS、SCD-1的蛋白表達水平降低（均P＜0.05）;4轉染XBP-1s過表達質粒對IRE-1/XBP-1的影響:pcDNA3.1(+)-XBP1s組的活性XBP-1s表達水平比untrans

30、fection組、pcDNA3.1(+)組、pcDNA3.1(+)-XBP-1u組顯著，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），XBP-1u和p-IRE-1/IRE-1水平比pcDNA3.1(+)-XBP-1u組明顯降低(P＜0.05)，提示活性的XBP-1s被有效過表達，XBP-1s與XBP-1u、IRE-1符合負反饋調控;5轉染XBP-1s過表達質粒對HepG2細胞脂質沉積的影響:pcDNA3.1(+)-XBP1s組TG升高50％，差異

31、有統(tǒng)計學意義，(P＜0.01)，油紅O染色示脂滴增多;6轉染XBP-1s過表達質粒對脂質從頭合成的影響:pcDNA3.1(+)-XBP1s組SREBP-1c的基因水平的表達增加(P＜0.01)，ACC、SCD-1的蛋白表達增加（均P＜0.01），F(xiàn)AS的蛋白表達增加(P＜0.05)，ChREBP無明顯變化。
　　結論:1轉染針對HepG2細胞XBP-1的shRNA后，高果糖所誘導的甘油三脂沉積可以被緩解，同時，SREBP-1c和A

32、CC、FAS、SCD-1的表達水平有所下降，提示IRE-1/XBP-1通路與脂質從頭合成有關;2上調HepG2細胞XBP-1s后，可以引起甘油三脂沉積，SREBP-1c和ACC、FAS、SCD-1表達水平增加，提示SREBP-1c可能是IRE-1/XBP-1通路誘導肝細胞脂質從頭合成的重要靶點，而ChREBP可能并未參與該過程。
　　第四部分 PERK/eIF-2α/ATF-4信號通路對HepG2細胞脂質從頭合成的影響究
　

33、　目的:探討敲低或過表達ATF-4對HepG2細胞的TG，脂質沉積和SREBP-1c、ChREBP和ACC、FAS、SCD-1的影響。
　　方法:首先轉染針對HepG細胞ATF-4的siRNA，分為四組:正常對照組（簡稱N組）、高果糖組（簡稱F組）、高果糖+陰性對照組（簡稱F+NC組）、高果糖+ ATF-4 siRNA組（簡稱F+ ATF-4 siRNA組），之后轉染針對HepG細胞ATF-4 siRNA的過表達質粒，分為四組:未

34、轉染組（簡稱Untransfection組）、陰性對照組（簡稱NC組）、ATF-4上調組（簡稱ATF-4+組），測定各組HepG2細胞內TG水平和油紅O染色觀察細胞脂質沉積，檢測各組與肝臟脂質從頭合成的上游轉錄因子SREBP-1c和ChREBP的基因水平，下游脂質合成的關鍵酶類ACC、FAS、SCD-1以及CHOP。
　　結果:1轉染ATF-4 siRNA對ATF-4和CHOP的影響:F+ATF-4 siRNA組ATF-4的表達水

35、平比F組顯著降低大于70％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，說明ATF-4表達水平被有效抑制;轉染ATF-4 siRNA對CHOP的影響:F+ATF-4 siRNA組CHOP的表達水平比F組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);2轉染ATF-4 siRNA對HepG2細胞脂質沉積的影響:F+ATF-4 siRNA組TG比F組降低了25％，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，油紅O染色示脂滴減少，F(xiàn)+NC組TG無變化(P＞0.05)，油

36、紅O染色示大量紅染，與F組無明顯差異;3轉染ATF-4 siRNA對脂質從頭合成的影響:ATF-4 siRNA組與F組比較SREBP-1c的基因水平降低了28％(P＜0.01)，ChREBP的基因水平降低了20％(P＜0.05)，ACC、FAS、SCD-1的蛋白表達水平降低（均P＜0.01）;4轉染ATF-4過表達質粒對ATF-4和CHOP的影響:ATF-4+組ATF-4的表達水平比untransfection組、NC組，差異有統(tǒng)計學意

37、義（均P＜0.01），提示ATF-4被有效過表達;CHOP的蛋白表達水平增加（P＜0.01）;5轉染ATF-4過表達質粒對HepG2細胞脂質沉積的影響: ATF-4+組TG升高40％，有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，油紅O染色示脂滴增多;6轉染ATF-4過表達質粒對脂質從頭合成的影響:ATF-4+組SREBP-1c和ChREBP的基因水平的表達增加（均P＜0.01），ACC、FAS、SCD-1的蛋白表達增加（均P＜0.05）。
　　

38、結論:1轉染針對HepG2細胞ATF-4的干擾siRNA后，高果糖所誘導的甘油三脂沉積可以被緩解，同時，SREBP-1c、ChREBP和ACC、FAS、SCD-1的表達水平有所下降，提示PERK/eIF-2α/ATF-4通路與脂質從頭合成有關;2上調HepG2細胞ATF-4后，可以引起甘油三脂沉積，SREBP-1c、ChREBP和ACC、FAS、SCD-1表達水平增加，SREBP-1c和ChREBP可能共同參與PERK/eIF-2α/A