內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過SREBP-1c-FAS途徑影響肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積.pdf

1、研究背景與目的:非酒精性脂肪肝（NAFLD）是由非酒精性因素引起的肝細(xì)胞脂質(zhì)過量蓄積而導(dǎo)致的一種慢性代謝紊亂性疾病。由于NAFLD在國內(nèi)外的發(fā)病率逐年上升，闡明其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)顯得十分必要。近年，不斷有研究提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)與NAFLD的發(fā)生存在相關(guān)性。固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白(SREBP)-1c、肝X受體(LXRs)通過調(diào)節(jié)下游靶基因脂肪酸合成酶（FAS）參與肝細(xì)胞內(nèi)脂肪酸從頭合成。并且，SREBP-1c

2、的表達(dá)調(diào)控分為轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平，即前體蛋白和活性蛋白兩部分。本研究擬應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動(dòng)劑毒胡蘿卜素（Tg）建立肝細(xì)胞ERS模型，了解ERS狀態(tài)下對肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)和免疫蛋白印跡法(Western-blot)觀察FAS、SREBP-1c（前體蛋白和活性蛋白）、LXRα的表達(dá)變化，探討毒胡蘿卜素誘導(dǎo)ERS引起肝細(xì)胞脂肪沉積的可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng):將人肝L02細(xì)

3、胞和HepG2細(xì)胞分別用含10％胎牛血清、0.0625g/L青霉素、0.1g/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液和高糖DMEM培養(yǎng)液，37℃、5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
　　 2、實(shí)驗(yàn)分組:正常對照組（培養(yǎng)液中不加藥物）和實(shí)驗(yàn)組（培養(yǎng)液中加入最佳實(shí)驗(yàn)濃度的毒胡蘿卜、素）。
　　 3、CCK-8比色法測定細(xì)胞增殖，Western Blot法檢測毒胡蘿卜素刺激后肝細(xì)胞葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78的表達(dá)情況，TG試劑

4、盒和油紅O染色了解肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況。
　　 4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測肝細(xì)胞內(nèi)LXRα、SREBP-1c、FAS mRNA及蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響
　　 1、毒胡蘿卜素最佳作用濃度及時(shí)間點(diǎn)的篩選:通過CCK8方法檢測24h、48h、72h下0.5、1、2、4μmol/L濃度毒胡蘿卜素作用L02細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果顯示72h時(shí)0.5μm

5、ol/L毒胡蘿卜素對細(xì)胞生長抑制率達(dá)到20％，結(jié)合參考文獻(xiàn)，選用1μtmol/L為最佳藥物濃度，24h、48h作藥物作用時(shí)間。
　　 2、各組GRP78表達(dá)檢測:1μtmol/L毒胡蘿卜素誘導(dǎo)L02、HepG2細(xì)胞24h、48h后GRP78蛋白表達(dá)較對照組明顯升高，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（L02細(xì)胞、HepG2細(xì)胞分別為F=29.39、34.56，p=0.0008、0.0005)，說明1μmo l/L毒胡蘿卜、素成功誘導(dǎo)建立肝細(xì)

6、胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型。
　　 3、各組脂質(zhì)的檢測
　　 (1) TG檢測:L02細(xì)胞中，經(jīng)毒胡蘿卜素處理后，與對照組相比，24h實(shí)驗(yàn)組TG檢測差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而48h實(shí)驗(yàn)組(145.50±2.48μg/mg)較對照組(96.54±4.03μg/mg)脂肪沉積增加，后續(xù)研究選取48h作為誘導(dǎo)時(shí)間。用毒胡蘿卜素對HepG2細(xì)胞處理48h后，與對照組(121.52±4.73μg/mg)相比，實(shí)驗(yàn)組(276.98±6.68μg/m

7、g) HepG2細(xì)胞脂肪沉積顯著增加。
　　 (2)油紅O染色:與對照組相比較，經(jīng)毒胡蘿卜素處理48h后L02和HepG2細(xì)胞形態(tài)改變、脂肪沉積明顯。
　　 第二部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝影響的機(jī)制
　　 1、肝細(xì)胞內(nèi)LXRα、SREBP-1c mRNA的表達(dá)情況:與對照組比較，1μmol/L毒胡蘿卜素作用肝細(xì)胞48h后，實(shí)驗(yàn)組SREBP-1c mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而LXRα mRNA的表達(dá)量

8、，實(shí)驗(yàn)組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、肝細(xì)胞內(nèi)LXRα、SREBP-1c和FAS蛋白的表達(dá)情況:分別檢測SREBP-1c前體蛋白和活性蛋白，結(jié)果顯示SREBP-1c在蛋白水平，前體蛋白實(shí)驗(yàn)組較對照組增加，并且活性蛋白與前體蛋白呈現(xiàn)一致的趨勢。同時(shí)，F(xiàn)AS的蛋白表達(dá)情況與SREBP-1c相同，實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞較對照組增加。然而，LXRα蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、毒

9、胡蘿卜素可誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并引起脂質(zhì)沉積。
　　 2、在肝細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致脂代謝紊亂的過程中，SREBP-1c轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后及FAS表達(dá)水平均明顯升高，顯示SREBP-1c-FAS可能是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的重要機(jī)制。
　　 3、在肝細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致脂代謝紊亂的過程中，LXRαmRNA及蛋白水平均無明顯變化，提示LXRs-SREBP-1c和LXRs-FAS途徑可能沒有參與毒胡蘿卜、素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)