高糖對(duì)腎小球系膜細(xì)胞生物鐘基因表達(dá)的影響及機(jī)制探討.pdf

1、目的:晝夜節(jié)律(Circadian rhythm)是自然界最普遍的自然現(xiàn)象之一，晝夜節(jié)律生物鐘(Circadian clock)就是設(shè)定并調(diào)控機(jī)體出現(xiàn)這種晝夜節(jié)律的系統(tǒng)，是一種以近似24小時(shí)為周期的晝夜節(jié)律振蕩器(Circadian oscillator)。生物鐘與太陽(yáng)光周期變化、物質(zhì)代謝和能量攝取同步。血糖作為物質(zhì)代謝和能量攝取的重要環(huán)節(jié)及組成部分，大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)生物鐘基因表達(dá)水平高低與血糖水平密切相關(guān)，生物鐘基因的缺失可

2、導(dǎo)致胰島素分泌減少、胰島素分泌節(jié)律紊亂，生物鐘節(jié)律紊亂成為糖尿病發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素。但目前尚無(wú)研究系統(tǒng)探討高糖對(duì)生物鐘基因的影響及生物鐘基因在糖尿病并發(fā)癥發(fā)病中的作用及機(jī)制，故本研究通過(guò)觀察小鼠腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cell，GMC)生物鐘基因在不同濃度高糖及在活性氧(Reactive oxygen species，ROS)抑制劑N-乙酰半胱氨酸(N-acctyl-L-cystcinc，NAC)干預(yù)下

3、的表達(dá)變化，同時(shí)檢測(cè)小鼠腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子表達(dá)變化，旨在探討高糖對(duì)腎小球系膜8個(gè)生物鐘基因表達(dá)的影響及作用機(jī)制。
　　方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組:體外培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細(xì)胞，以不同濃度高糖作為刺激因素，活性氧抑制劑NAC作為ROS阻斷劑干預(yù)高糖作用，分別設(shè)為以下4組:(1)正常對(duì)照組（normal control group，NC組）:培養(yǎng)基含5.6mmol/L葡萄糖;(2)滲透壓對(duì)照組(osmotic pres

4、sure group， OP組）:培養(yǎng)基含5.6mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L甘露醇（滲透壓約等于30mmol/L高糖組）;(3)不同濃度高糖組（high glucose group，HG組）:培養(yǎng)基分別含10mmol/L葡萄糖(HG1組)、20mmol/L葡萄糖（HG2組）、30mmol/L葡萄糖（HG3組）;(4) NAC+高糖組(NAC+HG組):表達(dá)變化最強(qiáng)濃度的高糖組預(yù)先加入10μmol/L活性氧抑制劑NAC工作液作

5、為干預(yù)因素，了解活性氧在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞生物鐘基因改變中的作用。2.檢測(cè)方法:(1)各組小鼠腎小球系膜細(xì)胞適時(shí)隨機(jī)分別加入不同作用物培養(yǎng)24小時(shí)后用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中8個(gè)生物鐘基因CLOCK，BMAL1，REV-ERBα，Per1，Per2，Per3，Cry1，Cry2 mRNA表達(dá)水平變化;(2)各組小鼠腎小球系膜細(xì)胞適時(shí)隨機(jī)分別加入作用物培養(yǎng)24小時(shí)后裝載2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽探針(2'，7'-Dichloro

6、fluorescin Diacetate，DCFH-DA)，用分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化;(3)各組小鼠腎小球系膜細(xì)胞適時(shí)隨機(jī)分別加入作用物培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心后取上清液用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子白介素-6(Interleukin-6，IL-6)及C-C趨化因子配體-2(C-Cchemokine ligand2，CCL-2;又稱為單核細(xì)胞趨化蛋白-1，monocytechemotactic prot

7、ein1，MCP-1）的表達(dá)變化。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，組內(nèi)比較采用方差齊性檢驗(yàn)，各組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法，我們定義P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.與正常對(duì)照組相比，高糖組小鼠腎小球系膜細(xì)胞生物鐘基因 CLOCK, BMAL1, REV-ERBα, Per1, Per2, Per3, Cry1, Cry2 m

8、RNA表達(dá)水平均增加(P＜0.05)，其中CLOCK，BMAL1，REV-ERBα，Per1，Per2，Per3，Cry2 mRNA表達(dá)增加呈濃度依賴性;同時(shí)，與正常對(duì)照組相比，高糖組小鼠腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)ROS水平及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6及CCL-2表達(dá)水平均呈濃度依賴性增加(P＜0.05)。2.與高糖組相比，預(yù)先加入NAC干預(yù)高糖氧化應(yīng)激作用后可阻止高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞CLOCK，BMAL1，REV-ERBα，Per1，Pe