SS-31對高糖誘導小鼠腎小球系膜細胞調亡的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是全球終末期腎臟疾病的首要原因。實驗性DN證實，腎小球固有細胞缺失和系膜細胞凋亡與蛋白尿惡化有關。先前的研究表明，高糖(high glucose，HG)誘導系膜細胞凋亡引起系膜細胞缺失是導致糖尿病腎損傷的主要機制。
　　高糖通過產生糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)、激活蛋白激酶C(protein kinase

2、 C，PKC)、增加轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、GTP結合蛋白和細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)表達等途徑介導細胞凋亡。ROS是各種途徑的共同特征，也是高血糖損傷機制的核心。正常情況下，ROS受內源性抗氧化劑系統(tǒng)控制，包括維生素C、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶等。當ROS與抗氧化劑之間的平衡被打破時即發(fā)生氧化應激。過多的

3、ROS通過氧化膜磷脂、蛋白和核酸觸發(fā)凋亡通路并最終引起細胞死亡。我們最近的研究表明，抗氧化劑Tempol或敲低TXNIP能夠抑制HG誘導的小鼠腎小球系膜細胞凋亡、ROS產生和p38 MAPK及ASK1活化。以上研究結果表明，高糖通過氧化劑依賴機制誘導腎小球系膜細胞凋亡。
　　ROS產生的主要部位是線粒體，在糖尿病血管并發(fā)癥中起著重要作用。SS-31肽(D-Arg-2’，6’-dimethyltyrosine-Lys-Phe-NH2

4、)屬于小分子可滲透細胞的肽家族，靶向聚集在ROS產生的部位--線粒體內膜。SS-31能夠清除細胞內ROS和減少線粒體ROS產生，從而防止線粒體通透性改變(mitochondrial permeability transition，MPT)和細胞色素C釋放。以往的研究表明，SS-31能夠抑制單側輸尿管梗阻大鼠腎小管上皮細胞凋亡和腎小管損傷。高糖處理人視網膜上皮細胞的研究發(fā)現，SS-31能減少細胞凋亡和線粒體ROS產生、穩(wěn)定線粒體膜電位(△

5、Ψm)、減少細胞色素C由線粒體向胞漿釋放和caspase-3表達。然而，SS-31在HG誘導的小鼠腎小球系膜細胞凋亡中的作用是未知的。
　　我們推測，SS-31能夠通過減少線粒體ROS產生和防止線粒體氧化損傷，從而抑制高糖誘導的細胞凋亡。在本研究中，我們應用體外培養(yǎng)的小鼠腎小球系膜細胞(mouse mesangial cells，MMCs)觀察了SS-31對HG誘導的ROS產生、細胞凋亡、線粒體功能障礙和p38 MAPK及ASK1

6、活化的影響。
　　方法：小鼠系膜細胞(MMCs，ATCC no.CRL-1927)來自美國菌種保藏中心(Manassas，VA)。細胞培養(yǎng)于含有10％胎牛血清，2 mM L-谷氨酰胺，100 IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基中，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待MMCs達75％～85％融合后，用無血清培養(yǎng)基同步細胞24 h。細胞分組如下：正常糖組NG(5.6 mM)，NG+甘露醇組(24.4

7、 mM)作為滲透對照，高糖組HG(30 mM)，HG+SS-31組(100 nM)。于刺激48h后收集細胞及上清液，進行以下檢測：采用原位末端轉移酶標記技術(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediateddUTP-biotin nick end labeling assay，TUNEL)及流式細胞術檢測細胞凋亡率；流式細胞術檢測線粒體膜電位及線粒體ROS產生；Western blot檢測ca

8、spase-3、Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、p38 MAPK、p-p38 MAPK、ASK1、P-ASK1、TXNIP、TRX-2及細胞色素C的表達；real-time PCR檢測TXNIP、TRX-2 mRNA的表達。
　　結果：
　　1.SS-31對高糖誘導小鼠系膜細胞凋亡的影響
　　TUNEL和流式細胞術檢測結果表明，與正常糖對照組(NG)相比，高糖組凋亡細胞數顯著增加；與高糖組相比，

9、SS-31干預能夠顯著減少高糖誘導的細胞凋亡。與NG組相比，高糖組Cleaved caspase-3表達和Bax/Bcl-2比率顯著增加；SS-31干預能夠顯著抑制HG誘導的Cleavedcaspase-3表達和Bax/Bcl-2比率。甘露醇對細胞凋亡，Cleaved caspase-3表達和Bax/Bcl-2比率無影響。
　　2.SS-31對HG誘導的系膜細胞線粒體細胞色素C釋放的影響
　　與NG組相比，高糖組胞漿中的細胞

10、色素C水平明顯增加；與高糖組相比，SS-31干預組細胞胞漿中細胞色素C水平明顯降低。甘露醇組與NG組相比，胞漿中細胞色素C水平無明顯差異。
　　3.SS-31對HG誘導的系膜細胞ROS產生及△Ψm的影響
　　高糖組系膜細胞ROS表達較NG組顯著升高；SS-31干預組細胞ROS表達明顯低于高糖組。與NG組相比，高糖組系膜細胞△Ψm明顯下降；SS-31干預組細胞△Ψm與高糖組相比明顯升高。甘露醇組與NG組相比，ROS及△Ψm水平

11、無明顯差別。
　　4.SS-31對HG誘導系膜細胞TXNIP和TRX-2表達的影響
　　HG處理系膜細胞48 h后，TXNIP mRNA和蛋白表達水平均明顯上調；SS-31干預組能夠顯著抑制HG誘導的TXNIP mRNA及蛋白的表達。與NG組相比，高糖組TRX-2 mRNA和蛋白的表達無明顯改變；與高糖組相比，SS-31干預組系膜細胞TRX-2mRNA和蛋白表達均明顯升高。甘露醇組與NG組相比，TXNIP和TRX-2 mRN

12、A和蛋白水平無明顯差別。
　　5.SS-31對高糖誘導系膜細胞p38 MAPK和ASK1的激活的影響
　　與NG組相比，HG組p38 MAPK和ASK1的激活顯著增加；而SS-31處理顯著抑制HG誘導的p38 MAPK和ASK1磷酸化。甘露醇組與NG組相比，p38 MAPK和ASK1磷酸化水平無明顯差異。
　　結論：SS-31通過減少ROS產生，保護線粒體功能，抑制TXNIP表達和p38MAPK及ASK1激活，并增加T